تسمّي التحليلات التكاملية لترانسكريبتوم الخلايا الكلية والمنفردة والمكانية جين PPARG كجين تنبؤي مرشح مرتبط بالهرم في الساركوما العظمية

Yongwen Li; Wentao Qin; Tuo Liang; Rubiao Qiu; Zide Zhang

doi:10.3791/73062

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

تسمّي التحليلات التكاملية لترانسكريبتوم الخلايا الكلية والمنفردة والمكانية جين PPARG كجين تنبؤي مرشح مرتبط بالهرم في الساركوما العظمية

5 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/73062

⸱

سبتمبر 25, 2026

Yongwen Li^*¹ , Wentao Qin^*² , Tuo Liang² , Rubiao Qiu³ , Zide Zhang²

¹Traditional Chinese Medicine Department, Liuzhou People's Hospital, ²Spinal Surgery Department, Liuzhou People's Hospital, ³Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

باستخدام تحليلات ترانسكريبتوميا الكتلة (bulk)، والخلايا المفردة (single-cell)، والترانسكريبتوميا المكانية (spatial transcriptomic)، جنبًا إلى جنب مع نمذجة البقاء القائمة على التعلم الآلي والتحقق التجريبي، يرشح هذا البحث جين PPARG كجين إنذاري مرشح مرتبط بالشيخوخة في الساركوما العظمية، ويربط انخفاض تعبيره بسوء معدلات البقاء في مجموعة TARGET-OS وبالسمات الوعائية والبيئية الدقيقة.

الملخص

لا يزال الساركوما العظمية (Osteosarcoma) يشكل تحدياً في حالات المرض النقيل أو المتكرر أو المقاوم للعلاج. هدفت هذه الدراسة إلى تحديد الجينات الإنذارية المرتبطة بالشيخوخة وتوصيف سياقاتها المكانية. أُجري تحليل التعبير التفاضلي المزدوج في مجموعة GSE99671 باستخدام DESeq2، متبوعاً بتقاطع مع مجموعة جينات الشيخوخة CellAge. تم الحصول على البيانات الترانسكريبتومية من مجموعة TARGET-OS من UCSC Xena. قُيمت الجينات المرشحة باستخدام انحدار Cox أحادي المتغير، وتحليل Kaplan-Meier، وتحليل خصائص تشغيل المستقبل المعتمد على الوقت، وانحدار LASSO Cox، وتحليل LASSO المتكرر، ونمذجة الغابة العشوائية للبقاء، مع دمج المتغيرات السريرية المرافقة في نماذج Cox المعدلة. ولتوصيف ذلك، استُخدم الإثراء الوظيفي، وتحليل البيئة الدقيقة المناعية، والترانسكريبتوميات أحادية الخلية، والترانسكريبتوميات المكانية SP_BS3، والتحقق من التعبير في GSE36001، والتحقق بواسطة qRT-PCR وWestern blot في خلايا الساركوما العظمية 143B وخلايا بانية العظم. في GSE99671، تم التعبير عن 2,248 جيناً بشكل تفاضلي مع قيمة P معدلة < 0.05، وأدى تقاطعها مع جينات CellAge البالغ عددها 866 جيناً إلى الحصول على 105 جينات معبر عنها تفاضلياً ومرتبطة بالشيخوخة. وفي TARGET-OS، ارتبط انخفاض تعبير PPARG بزيادة خطر الوفاة (HR أحادي المتغير = 0.603، 95% CI = 0.454–0.802، P = 0.000494؛ HR المعدل = 0.224، 95% CI = 0.085–0.589، P = 0.00241). أدى إضافة PPARG إلى النموذج السريري إلى زيادة مؤشر C-index من 0.707 إلى 0.829. كان تعبير PPARG منخفضاً في كل من GSE99671 وGSE36001، وأكد qRT-PCR وWestern blotting انخفاض تعبير mRNA وبروتين PPARG في خلايا الساركوما العظمية 143B مقارنة بخلايا بانية العظم. حدد التحليل أحادي الخلية موقع PPARG في الخلايا البطانية، والبريسيتات (pericytes)، والبلعميات/الوحيدات، والخلايا السدوية المرتبطة بالأورام. أظهر تحليل الترانسكريبتوميات المكانية ارتباطات إيجابية ضعيفة ولكنها ذات دلالة إحصائية بين تعبير PPARG ودرجات الشيخوخة في CellAge، والدرجات المرتبطة بالخلايا البطانية، والدرجات المرتبطة بالبريسيتات. ترشح هذه النتائج PPARG كعلامة بيولوجية إنذارية مشتقة من CellAge مرتبطة ببقاء غير مواتٍ وخصائص البيئة الدقيقة الوعائية في الساركوما العظمية، وتدعم البحث في صلتها المحتملة بتصنيف المخاطر والبيئة الدقيقة للورم المرتبطة بالشيخوخة. وفرت GSE36001 تحققاً خارجياً من التعبير فقط؛ ولم يتم إجراء تحقق مستقل من البقاء.

المقدمة

يعد الساركوما العظمية (Osteosarcoma) الورم العظمي الخبيث الأولي الأكثر شيوعاً لدى الأطفال والمراهقين والبالغين الصغار¹. وعلى الرغم من أن العلاج الكيميائي متعدد العوامل والمدمج مع الجراحة قد أدى إلى تحسين النتائج في الحالات الموضعية²^,³، إلا أن المرضى الذين يعانون من ساركوما عظمية نقيلية أو متكررة أو مقاومة للعلاج لا يزالون يعانون من ضعف في معدلات البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل³^,⁴. وتشير الأدلة الناشئة إلى أن إعادة تشكيل فوق الجينية الناجمة عن الإجهاد التأكسدي يمكن أن تسهل التكيف النقيلي وتطور الورم، مما يسلط الضوء على اللدونة الجزيئية المعقدة التي تكمن وراء الأنماط الظاهرية السرطانية العدوانية⁵. ولا تزال المؤشرات الحيوية القوية التي تكون قابلة للتفسير سريرياً ومعلوماتية بيولوجياً محدودة. لذلك، يظل تحديد الميزات الجزيئية التي ترصد تباين الساركوما العظمية والمخاطر الإنذارية عبر طبقات متعددة من البيانات أمراً بالغ الأهمية.

يُعد الشيخوخة الخلوية برنامجاً مستقراً لتوقف الدورة الخلوية، يتم تحفيزه عن طريق خلل التيلوميرات، وتضرر الحمض النووي DNA، والإجهاد التأكسدي، وتنشيط الجينات الورمية، والضغط العلاجي⁶. ويمكن للشيخوخة أن تحد من التكاثر الشاذ؛ ومع ذلك، يمكن للخلايا الهرمة أيضاً أن تعيد تشكيل البيئة الدقيقة للورم من خلال برامج التهابية، وبرامج كيموكينات، وعوامل نمو، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلوية⁷^,⁸. وفي حالة الساركوما العظمية، قد تعكس الجينات المرتبطة بالشيخوخة كلاً من حالات الإجهاد الذاتية للخلايا الورمية ومكونات البيئة الدقيقة غير الخبيثة، ومع ذلك، لم يتم تقييم أهميتها الإنذارية وتنظيمها المكاني بشكل منهجي.

يشفر جين PPARG مستقبل غاما المنشط بمكاثر البيروكسيسوم، وهو مستقبل نووي منشط باللجين يشارك في عملية استقلاب الدهون، والتنظيم الالتهابي، والتمايز الخلوي، والتعديل المناعي⁹. ويعتمد دور PPARG في السرطان على السياق¹⁰؛ ففي بعض الحالات، يرتبط PPARG بحالات التمايز والحالات المضادة للالتهاب، بينما قد يدعم في حالات أخرى البرامج التكيفية للأورام أو السدى. ومع ذلك، لا يزال نمط تعبيره، وقيمته الإنذارية، وتوطنه الخلوي والمكاني في الساركوما العظمية غير محددة بشكل كامل.

في الدراسة الحالية، تم تحديد الجينات ذات التعبير المتباين في GSE99671 ومقاطعتها مع مجموعة جينات الشيخوخة CellAge، مما أسفر عن 105 جينات مرتبطة بالشيخوخة وذات تعبير متباين. بعد ذلك، استُخدمت بيانات البقاء على قيد الحياة من TARGET-OS، وعدة مناهج للتعلم الآلي ونمذجة البقاء، والتعديل السريري لترشيح PPARG كجين محوري. تم توصيف PPARG بشكل أكبر باستخدام تحليلات وظيفية شاملة وتحليلات للبيئة الدقيقة المناعية، والنسخ أحادي الخلية، والنسخ المكاني، والتحقق من التعبير الخارجي من GSE36001، والتحقق بواسطة qRT-PCR وWestern blot في خط خلايا الساركوما العظمية 143B وخلايا بانية العظم البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

استخدمت هذه الدراسة مجموعات بيانات عامة وخطوط خلايا للتحليل والتحقق، ولم تتضمن مشاركين بشريين أو عينات أنسجة سريرية؛ وبناءً عليه، لم يكن الحصول على موافقة أخلاقية مطلوباً.

تحليل التعبير التفاضلي في تقاطع GSE99671 وCellAge
تم الحصول على بيانات العد الخام ومعلومات تجميع العينات لـ GSE99671 من GEO¹¹^,¹². تم تحليل ثماني عشرة زوجاً من عينات الساركوما العظمية والعينات الطبيعية المقابلة لها. أُجري تحليل التعبير التفاضلي المزدوج باستخدام DESeq2 مع صيغة التصميم ~ pair_id + condition، حيث مثّل pair_id تأثيرات الأفراد المزدوجة، بينما قارنت condition بين الأنسجة الورمية والأنسجة الطبيعية¹³. تم الإبقاء على الجينات التي تحتوي على عدات قراءة لا تقل عن 10 في ثلاث عينات على الأقل. عُرّف التعبير التفاضلي بأن تكون قيمة P المعدلة < 0.05، وطُبق حد أكثر صرامة وهو قيمة P معدلة < 0.05 و |log2FC| ≥ 1 لأغراض التصوير البياني. تم إيجاد التقاطع بين الجينات ذات التعبير التفاضلي و866 جيناً من جينات الشيخوخة في CellAge بعد تحويل رموز الجينات إلى أحرف كبيرة¹⁴. أُجري تحليل التعبير التفاضلي في برنامج R (الإصدار 4.3.2) باستخدام DESeq2 (الإصدار 1.40.2)، وحُسبت قيم P المعدلة باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg.

مجموعة TARGET-OS والنمذجة الإنذارية
تم الحصول على البيانات النسخية والسريرية لمجموعة TARGET-OS من UCSC Xena¹⁵. واستُخلصت قيم التعبير لـ 105 جينات مختلفة التعبير مرتبطة بالشيخوخة الخلوية. شملت الدراسة 85 مريضاً تتوفر لديهم بيانات كاملة عن وقت البقاء، وحالة البقاء، وبيانات التعبير للجينات المرشحة، مع تسجيل 27 حالة وفاة. وحُللت قيم التعبير الجيني الموحدة باستخدام انحدار Cox أحادي المتغير¹⁶، وتحليل البقاء لكابلان-ماير (Kaplan-Meier)، وتحليل خصائص تشغيل المستقبل (ROC) المعتمد على الوقت¹⁷. كما استُخدم انحدار LASSO Cox¹⁸، وتحليل استقرار LASSO المتكرر، ونمذجة الغابة العشوائية للبقاء لتقييم استقرار الاختيار وأهمية المتغيرات¹⁹. وحُسبت درجة المحور المتكاملة والتصنيف السريري المتكامل باستخدام المعايير الثنائية الصريحة الموضحة أدناه. أُجريت تحليلات البقاء في لغة R باستخدام حزم survival (الإصدار 3.5-7)، وtimeROC (الإصدار 0.4)، وglmnet (الإصدار 4.1-8)، وrandomForestSRC (الإصدار 3.2.2). وبالنسبة للفحص أحادي المتغير بطريقة Cox للجينات المرشحة الـ 105، طُبق تصحيح بنجاميني-هوخبيرج لمعدل الاكتشافات الكاذبة (FDR)، واعتُبرت الجينات التي كان فيها FDR < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

المعالجة المسبقة للنموذج، وتصنيف PPARG، وتحليل منحنى ROC المعتمد على الوقت
من بين 85 مريضاً حدثت 27 حالة وفاة، استُبعدت الجينات ذات التباين الصفري، وتم تعويض قيم التعبير المفقودة للجينات المرشحة باستخدام الوسيط، كما تم توحيد كل جين مرشح وفق مقياس z-score. وبالنسبة لتحليل Kaplan-Meier، تم تقسيم التعبير إلى فئتين بناءً على وسيط المجموعة: حيث خُصصت القيم التي تزيد بوضوح عن الوسيط لمجموعة التعبير العالي، والقيم التي تساوي الوسيط أو تقل عنه لمجموعة التعبير المنخفض (PPARG: n = 42 تعبير عالٍ و n = 43 تعبير منخفض). وكانت اختبارات Log-rank ثنائية الطرف. واستخدمت تحليلات ROC المعتمدة على الوقت حزمة timeROC مع تحديد event cause = 1، وترجيح احتمالية الرقابة العكسية الهامشية، وأوقات تقييم بلغت 365 و1,095 و1,825 يوماً، مع تعيين iid = FALSE. ولضمان أن تشير قيم العلامات الأعلى باستمرار إلى مخاطر أعلى، استُخدمت قيم التعبير الموحدة للجينات ذات معاملات Cox الموجبة، وضُربت في -1 بالنسبة للجينات الواقية ذات المعاملات السالبة.

طريقة LASSO وطريقة LASSO المكررة
تم تطبيق Cox LASSO باستخدام حزمة glmnet مع ضبط المعايير التالية: family = "cox"، وalpha = 1، مع إجراء معايرة مسبقة لدرجة z (وبالتالي تم ضبط standardize = FALSE)، واستخدام التحقق المتقاطع خماسي الطيات (five-fold cross-validation)، وtype.measure = "deviance"، وبذرة عشوائية 123. واستُخدم lambda.min كحل أساسي للمعاملات. أما تحليل الاستقرار فقد كرر عملية التحقق المتقاطع خماسي الطيات نفسها 300 مرة؛ حيث استخدم التكرار b البذرة 1000 + b (حيث b = 1,...,300). وبالنسبة لكل جين، كان تردد الاختيار هو نسبة التكرارات التي ظهر فيها معامل غير صفري عند lambda.min؛ كما تم تسجيل الاختيار غير الصفري عند lambda.1se.

الغابة العشوائية للبقاء
تم تطبيق غابة بقاء على جميع الجينات المرشحة المعيارية البالغ عددها 105 باستخدام randomForestSRC (الإصدار 3.2.2)، مع استخدام البذرة 123، و ntree = 1,000، و importance = TRUE، و na.action = "na.impute". تم الاحتفاظ بالإعدادات الافتراضية للحزمة الخاصة ببيانات البقاء: تقسيم log-rank، و mtry = 11 (سقف الجذر التربيعي لـ 105 من المتنبئات)، والحد الأدنى لحجم العقدة الطرفية = 15، و nsplit = 10 نقاط تقسيم عشوائية، وأخذ العينات بدون استبدال بكسر أخذ عينات 0.632، وأهمية المتغيرات بطريقة anti-split.

درجة مركز الربط المتكاملة
حصل كل جين من الجينات المرشحة ذات التعبير التفاضلي المرتبطة بـ CellAge والبالغ عددها 105 جينات على نقطة واحدة لكل معيار من المعايير الثنائية الستة التالية: (1) العضوية في تقاطع التعبير التفاضلي/CellAge (حصل جميع المرشحين على هذه النقطة لأن قيمة P المعدلة < 0.05 كانت مطلوبة قبل عملية التقييم)؛ (2) قيمة P الاسمية في تحليل Cox أحادي المتغير < 0.05؛ (3) قيمة P في اختبار Kaplan-Meier log-rank < 0.05؛ (4) متوسط المساحة تحت المنحنى (AUC) المعتمدة على الوقت لـ 3 و 5 سنوات ≥ 0.65؛ (5) تكرار اختيار lambda.min في repeated-LASSO عند المئوية السبعين أو أعلى بين المرشحين و > 0؛ و(6) أهمية الغابة العشوائية للبقاء (random-survival-forest) عند المئوية السبعين أو أعلى بين المرشحين و > 0. كانت جميع المعايير ذات وزن وحدة متساوٍ، مما أعطى درجة مركز ربط تتراوح من 0 إلى 6؛ وانتقلت الجينات التي سجلت ≥ 4 إلى مرحلة التعديل السريري (18 جيناً). كما تم تسجيل قيم FDR لـ Cox أحادي المتغير، واستُخدمت قيمة FDR < 0.05 للدلالة على أهمية الاختبارات المتعددة، إلا أن مؤشر التقييم المحدد مسبقاً استخدم قيمة P الاسمية < 0.05.

التصنيف المتكامل سريرياً
بعد دمج سجلات التعبير الجيني والسجلات السريرية، شملت التحليلات المعدلة 40 مريضاً لديهم سجلات كاملة للمتغيرات المصاحبة و13 حالة وفاة. كانت الدرجة النهائية عبارة عن درجة المحور (hub score) الأولية مضافاً إليها نقطة واحدة عن كل معيار من المعايير السبعة التالية: قيمة P المعدلة لاختبار Cox < 0.05، وقيمة P المعدلة لاختبار Cox < 0.10، وقيمة P لاختبار Cox للحساسية < 0.05 بعد استبعاد الجراحة النهائية، وقيمة P لاختبار Cox للحساسية < 0.10، ومتوسط AUC لمدة 3 و5 سنوات ≥ 0.65، وقيمة P لاختبار نسبة الاحتمالية (likelihood-ratio-test) < 0.10 للنموذج السريري والجيني مقابل النموذج السريري فقط، وقيمة delta AIC < 0. ونظراً لأن عتبتي 0.05 و0.10 كانتا متداخلتين، فإن القيمة P < 0.05 تمنح نقطتين، مما يعطي وزناً أكبر للأدلة الواضحة والمعنوية من اختبارات Cox المعدلة والحساسية. تراوح النطاق الإجمالي من 0 إلى 13؛ وتم حل حالات التعادل بناءً على قيمة P المعدلة الأصغر لاختبار Cox، تليها القيمة الأكبر لمتوسط AUC لمدة 3 و5 سنوات. حصل PPARG على جميع النقاط الست الأولية وجميع نقاط التكامل السريري السبع (13/13)، ليحتل المرتبة الأولى. وقد تم ذكر تحسن مؤشر C (C-index) بشكل وصفي ولم يتم تخصيص درجة له.

التعديل السريري
دُمجت الجينات المحورية المرشحة مع المتغيرات السريرية لـ TARGET-OS، والتي شملت الجنس، والعمر، وحالة المرض عند التشخيص، وموقع الورم الأولي، ومنطقة الورم المحددة، والجراحة النهائية. دخل في التحليلات المعدلة سريرياً أربعون مريضاً لديهم سجلات تعبير جيني وسجلات سريرية كاملة، بما في ذلك 13 حالة وفاة. وقورنت نماذج Cox التي تحتوي على المتغيرات السريرية فقط بنماذج تشمل المتغيرات السريرية بالإضافة إلى التعبير الجيني. استُخدم مؤشر C-index، ومعيار أكايكي للمعلومات (AIC)، وقيم P لاختبار نسبة الاحتمالية لتقييم تحسن النموذج. وأُجري تحليل الحساسية بعد إزالة متغير الجراحة.

تحليل الإثراء الوظيفي والبيئة المجهرية المناعية
تم تقسيم عينات TARGET-OS وفقاً لمستوى تعبير PPARG. واستُخدم التعبير التفاضلي بين المجموعتين (ذات التعبير العالي وذات التعبير المنخفض لـ PPARG) لإنشاء قوائم جينات مرتبة لتحليل إثراء مجموعة الجينات (GSEA)²⁰. وكانت المسارات المعروضة هي Nemeth Inflammatory Response LPS Up، وBurton Adipogenesis 5، وBurton Adipogenesis 6، وKrieg KDM3A Targets Not Hypoxia، وReactome: Transcriptional Regulation By TP53، وFulcher Inflammatory Response Lectin Vs LPS Dn، وHollmann Apoptosis Via CD40 Dn، وZhou Inflammatory Response Live Dn، وWP: Fatty Acids And Lipoproteins Transport In Hepatocytes، وSweet Lung Cancer KRAS Up، وKEGG Medicus Pathogen HIV Tat To TLR2/4 NF-kB Signaling Pathway، وReactome: Fatty Acids. كما تم حساب درجة شيخوخة عامة باستخدام CellAge، واستُخدم تحليل ارتباط سبيرمان لتقييم الروابط بين PPARG وجينات الشيخوخة أو سمات البيئة المجهرية المناعية²¹. وقُيمت الفروق في درجات البيئة المجهرية بين مجموعتي التعبير العالي والمنخفض لـ PPARG باستخدام اختبارات لا معلمية مع تصحيح الاختبارات المتعددة.

تحليل النسخ في الخلية الواحدة
تم تحليل مجموعة بيانات منسوخة من خلية واحدة لسرطان العظم البشري منشورة مسبقاً باستخدام كائن تمت معالجته مسبقاً، حيث أُنجزت بالفعل عمليات مراقبة الجودة، وتقليل الأبعاد، والتجميع، والتعليق التوضيحي اليدوي²²^,²³^,²⁴. شمل التحليل إجمالي 68,336 خلية و 32,297 جيناً. ولأغراض التفسير في النص الرئيسي، تم تبسيط التعليقات التوضيحية إلى 13 نوعاً رئيسياً من الخلايا: الخلايا البائية (B cells)، والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs)، والخلايا في طور الدورة، والخلايا البطانية، والخلايا الحمراء، والخلايا البلعمية/الوحيدات، وخلايا سرطان العظم الخبيثة، والخلايا العضلية، والخلايا المتعادلة، والخلايا الشبيهة بناقضات العظم، والخلايا الحولية، وخلايا T/NK، والخلايا السدوية المرتبطة بالورم. استُخدمت مخططات تقليل الأبعاد، وتعبير السمات، والمخططات النقطية، ومخططات الكمان لتصور تموضع PPARG. وعُرِفت الخلايا الموجبة لـ PPARG بأنها الخلايا التي يزيد تعبيرها عن صفر. كما تم تقييم الاختلافات بين أنواع الخلايا باستخدام اختباري Kruskal-Wallis و Wilcoxon rank-sum مع تصحيح Benjamini-Hochberg. أُجريت تحليلات الخلية الواحدة في بيئة R باستخدام حزمة Seurat (الإصدار 5.0.1).

تحليل النسخ المكاني
استُخدمت عينة النسخ المكاني SP_BS3 لإنشاء كائن تعبير مكاني²⁵^,²⁶. كانت عتبات مراقبة الجودة nFeature_Spatial ≥ 200 والنسبة المئوية للميتوكوندريا percent.mt ≤ 30، مما ترك 4,572 نقطة للتحليل. تم تطبيع البيانات، واختيار 3,000 جين عالي التباين، وأُجري تحجيم البيانات، وتحليل المكونات الرئيسية، وبناء مخطط الجوار، وتجميع النقاط المكانية، وتقليل الأبعاد. تم حساب درجة شيخوخة CellAge المكانية بعد إزالة PPARG من مجموعة الجينات لتجنب الارتباط الدائري. كما تم بناء وتقييم بصمات الخلايا البطانية، والخلايا الحولية، والبلعميات/الوحيدات، والسدى المرتبط بالأورام، والساركوما العظمية الخبيثة، والخلايا الشبيهة بناقضات العظم. استُخدم تحليل ارتباط سبيرمان لتقييم الروابط بين تعبير PPARG والدرجات المكانية. أُجري نقل التصنيف باستخدام مجموعة بيانات الخلية الواحدة كمرجع ومجموعة البيانات المكانية كاستعلام لاستنتاج درجات أنواع الخلايا المتوقعة لكل نقطة²³^,²⁴. أُجريت تحليلات النسخ المكاني في لغة R باستخدام Seurat (الإصدار 5.0.1)، وطُبق تصحيح Benjamini-Hochberg FDR على جميع قيم P للارتباط المكاني.

التحقق الخارجي من التعبير الجيني في GSE36001
استُخدمت مجموعة بيانات GEO رقم GSE36001 حصرياً كمجموعة تحقق مستقلة للتعبير الجيني؛ ونظراً لعدم توفر نتائج البقاء على قيد الحياة، لم تُستخدم للتحقق من التنبؤ بالمرض¹¹^,²⁷. شملت مجموعة البيانات 19 عينة من الساركوما العظمية وست عينات ضابطة طبيعية. استُخدم توصيف منصة GPL6102 لتحويل معرفات المجسات إلى رموز جينية. وعندما ارتبطت مجسات متعددة بنفس الجين، تم الاحتفاظ بالمجس الذي سجل أعلى متوسط تعبير جيني. قُيم التعبير التفاضلي بين المجموعتين الورمية والطبيعية باستخدام limma²⁸. أُجريت التحليلات في برنامج R باستخدام limma (الإصدار 3.56.2)، وحُسبت قيم P المعدلة باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg.

التحقق باستخدام qRT-PCR ولطخة ويسترن (Western blot)
أُجري التحقق التجريبي باستخدام خط خلايا الساركوما العظمية البشرية 143B وخلايا بانيات العظم البشرية. زُرعت خلايا الساركوما العظمية في وسط Dulbecco's modified Eagle's المدعم بـ 10% من مصل جنين البقر و1% من البنسلين-ستربتومايسين عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO₂، وتم نقلها باستخدام 0.25% trypsin-EDTA عند وصول التلاقي الخلوي إلى 80%–90%. تم الحفاظ على خلايا بانيات العظم البشرية وفقاً لظروف الزراعة الموصى بها. تم التأكد من خلو جميع خطوط الخلايا من التلوث بالمايكوبلازما. بالنسبة لـ qRT-PCR، استُخلص الرنا (RNA) الكلي باستخدام كاشف استخلاص RNA يعتمد على الفينول-جوانيدينيوم، وقُدر تركيز الرنا ونقاوته طيفياً. تم تحويل ميكروغرام واحد من الرنا الكلي إلى cDNA باستخدام كاشف النسخ العكسي وفقاً للبروتوكول الموصى به. أُجريت عملية qRT-PCR باستخدام كيمياء تعتمد على صبغة فلورية مرتبطة بالـ DNA تحت ظروف الدورات التالية: مسخ أولي عند 95 °C لمدة 30 s، يليه 40 دورة عند 95 °C لمدة 5 s و60 °C لمدة 30 s، مع تحليل منحنى الانصهار لتأكيد خصوصية التضخيم. أُجري كل تفاعل في ثلاث مكررات تقنية، ونُفذت ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة. استُخدم GAPDH كضابط داخلي، وحُسب التعبير النسبي لـ PPARG باستخدام طريقة 2^-ΔΔCt²⁹. كان بادئ PPARG الأمامي 5'-CGAAGACATTCCATTCACAAGAACAG-3'، والبادئ العكسي 5'-AGATGCAGGCTCCACTTTGATTG-3'.

أُجري تحليل لطخة ويسترن (Western blotting) لفحص التعبير البروتيني لـ PPARG. تم تحلل الخلايا في محلول منظم لـ مقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (radioimmunoprecipitation assay buffer) المضاف إليه مثبطات البروتياز، وحُددت تركيزات البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسينكونينيك (bicinchoninic acid assay). فُصلت كميات متساوية من البروتين (30 µg لكل ممر) بواسطة الفصل الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد ونوديسيل كبريتات الصوديوم بتركيز 10%، ثم نُقلت إلى أغشية بولي فينيليدين ثنائي الفلوريد. وبعد الحجب باستخدام حليب خالي الدسم بتركيز 5% لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة، حُضنت الأغشية طوال الليل عند 4 °C مع أجسام مضادة أولية ضد PPARG (بنسبة 1:1,000) و GAPDH (بنسبة 1:5,000)، متبوعة بحضن مع جسم مضاد ثانوي مقترن ببيروكسيداز الفجل (بنسبة 1:5,000) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. تم تصوير حزم البروتين باستخدام الكشف بالتألق الكيميائي، وأُجريت ثلاث تجارب مستقلة. كما تم قياس شدة الحزم باستخدام برنامج لتحليل الصور³⁰. وحُللت الفروق بين المجموعات باستخدام اختبار t لستودنت (Student's t tests) غير المقترن وذو الذيلين. عُرضت البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD) لثلاث تجارب مستقلة، واعتُبرت قيمة P < 0.05 ذات دلالة إحصائية. أُجريت التحليلات الإحصائية للبيانات التجريبية باستخدام برنامج للتحليل الإحصائي (الإصدار 9.0).

التحليل الإحصائي
ما لم يُنص على خلاف ذلك، أُجريت جميع التحليلات المعلوماتية الحيوية باستخدام برنامج R (الإصدار 4.3.2). ثنائي الجانب P قيم < اعتُبرت القيم التي تقل عن 0.05 دالة إحصائياً. وقُيمت الارتباطات باستخدام معامل ارتباط سبيرمان لرتب المتغيرات (ρ). أُجري تصحيح الاختبارات المتعددة باستخدام طريقة Benjamini-Hochberg لمعدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) حيثما كان ذلك مناسباً. عُرضت البيانات التجريبية في صورة المتوسط الحسابي ± والانحراف المعياري (SD)، وتمت المقارنة باستخدام اختبار Student's ثنائي الذيل لعينات غير مرتبطة تـ الاختبارات. وأُجريت التحليلات الإحصائية التجريبية باستخدام برنامج للتحليل الإحصائي (الإصدار 9.0).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

حددت مجموعة البيانات GSE99671 نحو 105 جيناً من جينات CellAge المرتبطة بالهرم والتي تظهر تعبيراً تفاضلياً
اشتملت GSE99671 على 36 عينة من 18 نسيجاً مزدوجاً. وبعد تصفية الجينات ذات التعداد المنخفض، تم الاحتفاظ بـ 16,683 جيناً. وعند قيمة P معدلة < 0.05، تبين وجود تعبير تفاضلي لـ 2,248 جيناً. وبناءً على عتبة أكثر صرامة تتمثل في قيمة P معدلة < 0.05 و |log2FC| ≥ 1، كانت هناك 594 جيناً ذات دلالة إحصائية، شملت 102 جيناً مرتفع التعبير و 492 جيناً منخفض التعبير في الأورام (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

رشحت هذه الدراسة جين PPARG كجين تنبئي مرشح مرتبط بالشيخوخة في الساركوما العظمية، وذلك من خلال دمج تحليل التعبير التفاضلي، وتقاطع جينات CellAge، ونمذجة البقاء على قيد الحياة في TARGET-OS، والتعديل السريري، والتوطين متعدد الأوميكس، والتحقق التجريبي. ويتوافق هذا الإطار التحليلي مع التركيز الحالي على أبحاث الساركوما العظمية القائمة على المعلومات الجزيئية ومصادر جينات الشيخوخة المنسقة لتفسير البيولوجيا المرتبطة بالشيخوخة¹⁴^,³¹. وقد تبين أن تعبير PPARG كان منخفضاً في ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

مساهمات المؤلفين:
قام Yongwen Li و Wentao Qin بتصور الدراسة وتصميمها. وأجرى Yongwen Li التحليلات المعلوماتية الحيوية والحسابية. وأجرى Tuo Liang التحقق التجريبي. وساهم Rubiao Qiu و Zide Zhang في إعداد الأشكال. كما أشرف Rubiao Qiu و Zide Zhang على الدراسة وراجعوا المخطوطة مراجعة نقدية. وقد راجع جميع المؤلفين المخطوطة النهائية ووافقوا عليها

شكر وتقدير

يعرب المؤلفون عن خالص امتنانهم للباحثين والمساهمين في مشاريع GEO، وTARGET-OS، وUCSC Xena، وCellAge، وMSigDB، وأطلس النسخ المفرد والمكاني لسرطان العظم البشري لتوفيرهم مجموعات البيانات والموارد المتاحة للعموم التي مكنت من إجراء هذه الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة قوانغشي للعلوم الطبيعية (رقم 2023GXNSFAA026111).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الأجسام المضادة الأولية Anti-GAPDH	Proteintech Group, Wuhan, China	10494-1-AP	جسم مضاد أولي يستخدم للكشف عن GAPDH كضابط تحميل في تحليل اللطخة الغربية؛ التخفيف 1:5,000.
الأجسام المضادة الأولية Anti-PPARG	Proteintech Group, Wuhan, China	16643-1-AP	جسم مضاد أولي يستخدم للكشف عن بروتين PPARG بواسطة تحليل اللطخة الغربية؛ التخفيف 1:1,000.
طقم مقايسة بروتين BCA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	PC0020	مقايسة لونية تستخدم لتحديد التركيز الكلي للبروتين قبل الفصل الكهربائي.
DESeq2	Bioconductor	Version 1.40.2	حزمة R تستخدم لتحليل التعبير الجيني التفاضلي لبيانات الترانسكريبتوم القائمة على العد.
وسط دلبيكو المعدل (DMEM)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	11995	وسط زراعة أساسي يستخدم للحفاظ على خلايا الساركوما العظمية 143B.
كاشف الكشف ECL	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	PE0010	ركيزة ذات تلألؤ كيميائي تستخدم للكشف عن الأجسام المضادة المقترنة بـ HRP في تحليل اللطخة الغربية.
مصل جنين البقر (FBS)	Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd. (Sijiqing), Huzhou, Zhejiang, China	11011-8611	مكمل مصلي يضاف إلى وسط الزراعة لدعم نمو الخلايا وحيويتها.
glmnet	CRAN	Version 4.1-8	حزمة R تستخدم لتحليلات الانحدار الموقوتة، بما في ذلك نمذجة LASSO والشبكة المرنة (elastic-net).
GraphPad Prism	GraphPad Software, San Diego, CA, USA	Version 9.0	برنامج يستخدم للتحليل الإحصائي، وإنشاء الرسوم البيانية، وتصور البيانات التجريبية.
جسم مضاد ثانوي مقترن بـ HRP	Proteintech Group, Wuhan, China	SA00001-2	جسم مضاد ثانوي مقترن ببيروكسيداز الفجل المستخدم للكشف في اللطخة الغربية؛ التخفيف 1:5,000.
خلايا بانية العظم البشرية	Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA	406-05A	خلايا بانية عظم بشرية أولية تستخدم كنوع خلوي ضابط/مقارن غير خبيث.
خط خلايا الساركوما العظمية البشرية 143B	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA	CRL-8303	خط خلايا ساركوما عظمية بشرية يستخدم لتجارب التحقق في المختبر والمقايسات الجزيئية.
ImageJ	National Institutes of Health (NIH), USA	Version 1.53	برنامج تحليل صور يستخدم للتحليل الكمي للصور التجريبية.
limma	Bioconductor	Version 3.56.2	حزمة R تستخدم لتحليل التعبير التفاضلي والاختبار الإحصائي القائم على النموذج الخطي.
بنسلين-ستريبتومايسين	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	P1400	مكمل مضاد حيوي يستخدم في وسط زراعة الخلايا لتقليل التلوث البكتيري.
بادئات PPARG وGAPDH	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai, China	Custom synthesis; sequences provided in the Methods	بادئات قليلة النوكليوتيد مصنعة خصيصاً تستخدم لتحليل qPCR للتعبير عن PPARG وGAPDH.
أغشية PVDF، 0.45 µm	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	YA1701	أغشية تستخدم لنقل البروتين أثناء تحليل اللطخة الغربية.
برنامج R الإحصائي	R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria	Version 4.3.2	بيئة حوسبة إحصائية تستخدم للتحليلات المعلوماتية الحيوية، وبناء النماذج، والتصور.
randomForestSRC	CRAN	Version 3.2.2	حزمة R تستخدم لنمذجة الغابة العشوائية للبقاء وتحليل أهمية الميزات.
طقم النسخ العكسي	Beyotime Biotech Inc., Shanghai, China	D7168M	يستخدم لتخليق الحمض النووي المتمم (cDNA) من الحمض النووي الريبي (RNA) المعزول قبل تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي.
محلول RIPA لتحليل الخلايا	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	R0010	محلول استخلاص البروتين يستخدم لتحليل الخلايا من أجل تحليل اللطخة الغربية.
Seurat	Satija Laboratory	Version 5.0.1	حزمة R تستخدم لمعالجة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، ودمجها، وتجميعها، وتصورها.
survival	CRAN	Version 3.5-7	حزمة R تستخدم لتحليل البقاء، بما في ذلك نمذجة مخاطر كوكس النسبية.
مزيج SYBR Green qPCR الرئيسي	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	SR1110	مزيج رئيسي فلوري يستخدم لتضخيم تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي.
timeROC	CRAN	Version 0.4	حزمة R تستخدم لإنشاء منحنيات خصائص تشغيل المستقبل المعتمدة على الوقت وحساب الأداء التنبؤي بمرور الوقت.
كاشف TRIzol	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15596026CN	كاشف يستخدم لاستخلاص الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي من الخلايا المزروعة.
تربسين-EDTA، 0.25%	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China	T1300	كاشف تفكيك الخلايا يستخدم لنقل وحصاد الخلايا الملتصقة.

المراجع

Mirabello L, Troisi RJ, Savage SA. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 2009;115:1531-1543.
Bielack SS, et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. J Clin Oncol. 2002;20:776-790.
Isakoff MS, Bielack SS, Meltzer P, Gorlick R. Osteosarcoma: Current Treatment and a Collaborative Pathway to Success. J Clin Oncol. 2015;33:3029-3035.
Kansara M, Teng MW, Smyth MJ, Thomas DM. Translational biology of osteosarcoma. Nat Rev Cancer. 2014;14:722-735.
Peng P, et al. Epigenetic remodeling under oxidative stress: Mechanisms driving tumor metastasis. MedComm - Oncology. 2024;3.
Muñoz-Espín D, Serrano M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:482-496.
Coppé JP, Desprez PY, Krtolica A, Campisi J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 2010;5:99-118.
Collado M, Serrano M. Senescence in tumours: evidence from mice and humans. Nat Rev Cancer. 2010;10:51-57.
Lehrke M, Lazar MA. The many faces of PPARgamma. Cell. 2005;123:993-999.
Peters JM, Shah YM, Gonzalez FJ. The role of peroxisome proliferator-activated receptors in carcinogenesis and chemoprevention. Nat Rev Cancer. 2012;12:181-195.
Barrett T, et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 2013;41.
Ho XD, et al. Whole transcriptome analysis identifies differentially regulated networks between osteosarcoma and normal bone samples. Exp Biol Med (Maywood). 2017;242:1802-1811.
Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15:550.
Avelar RA, et al. A multidimensional systems biology analysis of cellular senescence in aging and disease. Genome Biol. 2020;21:91.
Goldman MJ, et al. Visualizing and interpreting cancer genomics data via the Xena platform. Nat Biotechnol. 2020;38:675-678.
Prentice RL, Zhao S. Regression Models and Multivariate Life Tables. J Am Stat Assoc. 2021;116:1330-1345.
Heagerty PJ, Lumley T, Pepe MS. Time-dependent ROC curves for censored survival data and a diagnostic marker. Biometrics. 2000;56:337-344.
Tibshirani R. The lasso method for variable selection in the Cox model. Stat Med. 1997;16:385-395.
Jaeger BC, et al. OBLIQUE RANDOM SURVIVAL FORESTS. Ann Appl Stat. 2019;13:1847-1883.
Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:15545-15550.
Newman AM, et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat Methods. 2015;12:453-457.
Zhou Y, et al. Single-cell RNA landscape of intratumoral heterogeneity and immunosuppressive microenvironment in advanced osteosarcoma. Nat Commun. 2020;11:6322.
Stuart T, et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 2019;177:1888-1902.e21.
Hao Y, et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 2021;184:3573-3587.e29.
Zheng X, et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human osteosarcomas. J Hematol Oncol. 2024;17:71.
Ståhl PL, et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 2016;353:78-82.
Kresse SH, et al. Integrative analysis reveals relationships of genetic and epigenetic alterations in osteosarcoma. PLoS One. 2012;7.
Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43.
Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25:402-408.
Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 2012;9:671-675.
Gill J, Gorlick R. Advancing therapy for osteosarcoma. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18:609-624.
Sun L, et al. Single-cell RNA sequencing revealed PPARG promoted osteosarcoma progression: based on osteoclast proliferation. Front Immunol. 2024;15:1506225.
Yuan B, et al. Nuclear receptor modulators inhibit osteosarcoma cell proliferation and tumour growth by regulating the mTOR signaling pathway. Cell Death Dis. 2023;14:51.
Lu Y, et al. Oridonin exerts anticancer effect on osteosarcoma by activating PPAR-γ and inhibiting Nrf2 pathway. Cell Death Dis. 2018;9:15.
Gorgoulis V, et al. Cellular Senescence: Defining a Path Forward. Cell. 2019;179:813-827.
Faget DV, Ren Q, Stewart SA. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nat Rev Cancer. 2019;19:439-453.
Hernandez-Segura A, et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Curr Biol. 2017;27:2652-2660.e4.
Tian H, et al. Managing the immune microenvironment of osteosarcoma: the outlook for osteosarcoma treatment. Bone Res. 2023;11:11.
Hanahan D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 2022;12:31-46.
Ricote M, Li AC, Willson TM, Kelly CJ, Glass CK. The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of macrophage activation. Nature. 1998;391:79-82.
Jiang C, Ting AT, Seed B. PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines. Nature. 1998;391:82-86.
McShane LM, et al. REporting recommendations for tumour MARKer prognostic studies (REMARK). Br J Cancer. 2005;93:387-391.
Moses L, Pachter L. Publisher Correction: Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 2022;19:628.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

جينات التنبؤ بساركوما العظم الجينات المرتبطة بالشيخوخة تعبير PPARG ترانسكريبتوميكا الخلية الواحدة الترانسكريبتوميكا المكانية التعبير التفاضلي البيئة المجهرية المناعية انحدار كوكس لطخة ويسترن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR)