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感谢丁实验室所有成员提供的建议、专业知识和讨论。同时感谢德克萨斯大学达拉斯分校（UTD）流式细胞术核心设施提供的基础设施和技术支持。M.B.L. 受德克萨斯大学达拉斯分校尤金·麦克德莫特研究生奖学金资助。本研究得到了德克萨斯大学达拉斯分校启动基金以及美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH-NIGMS）对P.C.D.P.D.实验室的资助（项目编号：R35GM150967）。

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作者声明无竞争利益。支持本方案的原始数据，包括Nanopore测序FASTQ文件、流式细胞术（FCS）文件、用于生成图表和表格的源数据，以及质粒pDD1523和pDD1524，均已存入Zenodo，可公开获取，网址为10.5281/zenodo.20746804

定向进化是一种高通量方法，通过多样化和筛选的迭代循环，识别具有增强或新型生化功能的蛋白质17。在本实验方案中，我们详细描述了一种优化的工作流程，利用酿酒酵母（S. cerevisiae）的细胞表面展示系统来进化蛋白酶与底物之间的识别能力。该表面展示系统将蛋白酶活性转化为可检测的基于荧光的表型，从而实现基于流式细胞分选（FACS）的目标克隆富集。我们提供了蛋白酶文库和底物盒构建、高效电穿孔、FACS设门与分选，以及最终蛋白酶变异体测序的详细步骤。
定向进化中最关键的步骤之一是确保文库具有足够的多样性，并能充分覆盖潜在的突变谱17。我们的电穿孔效率实验表明，初始亚培养物在 OD600 为 3.0 时可获得最高的转化效率，超过 109 CFU。通过优化的酵母电穿孔技术实现的这一转化规模，显著高于传统的化学转化方法，从而能够充分覆盖大规模组合文库8,<...

Potyviridae 科的半胱氨酸蛋白酶，特别是核包含体A（NIa）蛋白酶，是一类尚未被充分开发的序列特异性内肽酶资源。该科已鉴定的成员超过3800种，NIa蛋白酶可特异性切割一个独特的七氨基酸底物序列。马铃薯Y病毒科为构建可编程蛋白质调控系统、设计正交蛋白酶遗传回路以及开发序列特异性的生物技术工具提供了多样化的蛋白酶资源1,2。尽管自然界中存在丰富的多样性，目前仅有两种NIa蛋白酶——烟草蚀纹病毒蛋白酶（TEVp）和烟草脉斑花叶病毒蛋白酶（TVMVp）——被系统表征并被广泛改造用于实验室及生物技术应用3,4。这一有限的蛋白酶工具集限制了需要多种正交蛋白酶活性的多组分回路的设计空间5，从而推动了通过定向进化手段进一步拓展和表征NIa蛋白酶的研究工作6,7。
酵母表面展示技术已成为定向进化领域最强大的平台之一，可通过荧光激活细胞分选（FACS）实现高通量蛋白文库筛选6,7。例如，酵母内质网滞留筛选（YESS）系统通过酿酒酵母（S. cerevisiae）的分泌途径将蛋白酶活性与表面展示耦合6,7。 YESS系统已被用于设计新型蛋白酶-底物特异性，并在多轮定向进化实验中展现出良好的应用价值&#160;。在该系统中，蛋白酶变体与包含带有表位标记的可切割底物盒的融合蛋白共表达，同时在EBY100酵母菌株中表达Aga1p表面锚定蛋白。通过使用荧光标记抗体进行差异性标记，可区分细胞表面展示的已切割与未切割底物盒。这种依赖于活性的展示机制可直接与基于FACS的多轮迭代筛选兼容，适用于包含107个或更多变体的文库6,7。
定向进化的基础前提是能够以足够大的规模引入变异文库，从而充分覆盖目标序列空间。对于跨越多个氨基酸位点的饱和突变文库，需要达到每微克DNA产生108至109个独立转化子的转化效率，以确保文库中引入的多样性在筛选后的群体中得到充分代表。目前已有多种将外源DNA导入S. cerevisiae的方法，但各自在通量上存在明显限制。传统的化学转化法使用乙酸锂/单链载体DNA/聚乙二醇（LiAc/ssDNA/PEG）体系，因其操作简便且易于获取而被广泛采用。然而，该方法通常仅能达到每微克DNA 104–106个菌落形成单位（CFU）的转化效率，难以满足大规模文库构建所需的序列多样性8。相比之下，电穿孔法通过施加高压电场瞬时增加细胞膜通透性，促进DNA的摄入。在现有转化方法中，电穿孔法始终表现出最高的转化效率，经优化的实验方案可实现108–109 CFU的转化产量9。研究发现，S. cerevisiae的电穿孔效率对细胞生长阶段、DNA质量及缓冲液组成高度敏感，这一特性已为文库规模的定向进化研究提供了可广泛借鉴的实验框架9。
本方案中使用的菌株为 S. cerevisiae EBY100，这是一种广泛采用的酵母表面展示宿主菌株。EBY100 由 Boder 和 Wittrup 构建，将一个在半乳糖诱导型 GAL1 启动子控制下的 AGA1 表达盒整合到蛋白酶缺陷型亲本菌株 BJ5465 的染色体 AGA1 位点中10。该菌株可从 ATCC 商业获取（目录号 MYA-4941；保藏人 K.D. Wittrup），其基因型为 MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−)。因此，Aga1p 和 Aga2p-底物表达盒融合蛋白均由同一个半乳糖诱导型启动子驱动表达，确保这两个亚基共诱导并组装成二硫键连接的 Aga1p–Aga2p 复合物，从而将展示的融合蛋白锚定在细胞壁上。
尽管EBY100在酵母展示应用中被广泛使用，但目前尚无已发表的实验方案针对该菌株在文库规模下的电转化过程进行系统优化。与EBY100相关的特定参数，例如收获时的最佳生长阶段、传代培养期间的培养基组成，以及初始600 nm光密度（OD₆₀₀）与电转化效率之间的定量关系，均未被充分阐明。600）和转化效率仍有待系统表征与优化。本文报道了EBY100的转化效率随培养物OD值单调增加600 收获时，处于对数生长后期的细胞转化效率显著高于对数生长早期收获的细胞。我们评估了关键的实验方案参数，包括初始OD600 接种时的数值，使用2 × 酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基进行传代培养，电穿孔缓冲液的配制，以及电穿孔后的扩增培养条件。本文所述方案提供了一种优化的、逐步操作的工作流程图1A–C, 图2, 图3A–D, 图 4A–E用于制备电转感受态EBY100细胞及高效DNA文库电转化，可稳定获得每微克DNA转化子数超过10^7的转化效率9 菌落形成单位。为验证本方案，我们开展了一项全面的定向进化实验，通过四轮基于流式细胞术分选（FACS）的筛选与富集，对TEV蛋白酶（TEVp）的切割特异性进行改造。对富集后的蛋白酶变体进行测序，结果显示蛋白酶底物结合口袋中靶向残基位点发生了显著多样化，证明该方案能够对序列空间实现充分的文库覆盖，从而支持有效的定向进化实验。本方案对于利用EBY100进行酵母表面展示结合定向进化，以及开展与FACS兼容的蛋白酶、抗体高通量筛选的研究人员具有广泛的应用价值。9,&#160;激酶11和受体12以及其他蛋白质。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP混合液</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>PCR 反应（表 1，表 3）</td></tr><tr><td>10倍浓度 PBS，pH 7.4</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>染色缓冲液基础（步骤 3.2&amp;ndash;3.3)</td></tr><tr><td>5X Q5反应缓冲液</td><td>NEB</td><td>B9027S</td><td>单独出售；也可与 Q5 聚合酶一同提供</td></tr><tr><td>琼脂，Bacto</td><td>BD Difco</td><td>281230-500g</td><td>SDCAA 琼脂平板（表5）；15 g/L</td></tr><tr><td>琼脂糖（低电渗/多用途/分子生物学级）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>凝胶电泳</td></tr><tr><td>抗FLAG PE抗体</td><td>BioLegend</td><td>637309</td><td>FACS 染色；PE 标记的抗 FLAG 抗体</td></tr><tr><td>抗HA标签抗体 [FITC]</td><td>GenScript</td><td>A01621</td><td>FACS 染色；FITC 标记的抗 HA 抗体</td></tr><tr><td>Bacto 胨䏡氨基酸</td><td>BD Difco</td><td>223120</td><td>SDCAA+、SGCAA+、SCAA 培养基（表5）；5 g/L</td></tr><tr><td>胰蛋白胨 / 胰酪蛋白胨</td><td>RPI</td><td>T60060-10000.0</td><td>LB/SOB 培养基制备；在 YPD 中配制成 20 g/L（表 5）</td></tr><tr><td>BSA，牛血清白蛋白，第五组分</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126575-10GM</td><td>0.5% PBS；染色缓冲液（步骤 3.2&amp;ndash;3.3)</td></tr><tr><td>BsmBI-v2（200 U）</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td>底物盒的Golden Gate组装（表8）</td></tr><tr><td>氯化钙溶液（1 M）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100mL</td><td>电穿孔缓冲液：终浓度 1 mM（表 5）</td></tr><tr><td>ColiRollers&amp;reg; 包被珠子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71013-3</td><td>通过将试剂瓶放入高压灭菌器中，在121℃下灭菌&amp;ordm;C，15 psi，15 分钟。</td></tr><tr><td>D-半乳糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A12813.30</td><td>250 g；用于SGCAA+诱导的20% w/v 储液（表5）</td></tr><tr><td>D-山梨醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1327300.10</td><td>电穿孔缓冲液（1 M）和扩增培养基（表5）</td></tr><tr><td>无水葡萄糖（D-葡萄糖）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>YPD、SDCAA+、20% w/v 葡萄糖储备液（表5）</td></tr><tr><td>Difco 酵母氮源基础培养基（不含氨基酸）</td><td>Sigma</td><td>Y0626-250G</td><td>6.7 g/L（SDCAA/SGCAA，表5）</td></tr><tr><td>Difco YPD 肉汤（预混型）</td><td>BD</td><td>242820-500g</td><td>预混YPD替代培养基；500 g</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>平衡缓冲液：终浓度 10 mM；分装 250 &amp;mu;L，储存 &amp;minus;20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. CyclePure PCR 纯化试剂盒</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6492-02</td><td>PCR产物纯化</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 胶回收试剂盒</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D2500-01</td><td>PCR后及限制性酶切后的凝胶纯化（步骤1.1.8、1.3.2）</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 I</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6942-02</td><td>质粒纯化（步骤 4.2）</td></tr><tr><td>甘油（Glycerol）&amp;ge;99%)</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td>50% v/v 甘油保存液原液（步骤 4.1.1）</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>SDCAA+ 和 SGCAA+：50 &amp;mu;g/mL 终浓度；替代 Sigma K0879-5G</td></tr><tr><td>KLD 酶混合液</td><td>NEB</td><td>M0554S</td><td>激酶-连接酶-DpnI；定点诱变</td></tr><tr><td>KLD反应缓冲液</td><td>NEB</td><td>B0554A</td><td>与 KLD 酶混合物一起使用</td></tr><tr><td>LB培养基（Lennox）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td>大肠杆菌液体培养</td></tr><tr><td>乙酸锂二水合物（LiOAc&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A17921.30</td><td>预处理缓冲液：终浓度 0.1 M；在加入 DTT 前添加（表 5）</td></tr><tr><td>Luria 琼脂（Luria-Bertani 琼脂）</td><td>RPI</td><td>L24020-2000.0</td><td>大肠杆菌涂布平板；替代 Sigma LB 琼脂 Lennox L2897-1KG</td></tr><tr><td>OmniPur 酪蛋白氨基酸</td><td>Sigma</td><td>2240-500GM</td><td>替代性酪蛋白氨基酸来源</td></tr><tr><td>pDD1523</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo.20746804</td><td>pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI；Gal1-Aga2-sfGFP</td></tr><tr><td>pDD1524</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo.20746804</td><td>pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩液</td><td>康宁</td><td>30-002-CI</td><td>SDCAA+、SGCAA+：终浓度1X</td></tr><tr><td>PstI-HF（5000 U）</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td>载体线性化（表10）；使用HF版本</td></tr><tr><td>Q5 HF DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>高保真聚合酶；Q5热启动的替代选择</td></tr><tr><td>Q5 高GC增强剂</td><td>NEB</td><td>B9028A</td><td>高GC含量PCR反应</td></tr><tr><td>Q5热启动DNA聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>PCR 组装与扩增（表1，表3）</td></tr><tr><td>rCutSmart 缓冲液 (10X)</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>随 PstI-HF 和 SphI-HF 一起提供（表 10）</td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>NEB</td><td>R3138L</td><td>额外的限制性内切酶</td></tr><tr><td>SOC培养基</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td>转化后恢复</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>LB/SOB 培养基制备</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td>培养基 pH 调节</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-500G</td><td>SDCAA 平板，SCAA 培养基：38 mM（表 5）</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠，无水物</td><td>VWR (BDH)</td><td>BDH4542-1KGP</td><td>SDCAA 培养基，SCAA 培养基：62 mM；替代 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 一水合物</td></tr><tr><td>SphI-HF（1000 U）</td><td>NEB</td><td>R3182S</td><td>PstI-HF（表10）介导的载体线性化</td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Life Technologies / Sigma</td><td>S6501-5g</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶缓冲液（10X）</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td>表6</td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶（500 U）</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>表6</td></tr><tr><td>T7 DNA连接酶（3000 U/mL）</td><td>NEB</td><td>M0318S</td><td>表8</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>RPI</td><td>Y20020-5000.0</td><td>YPD（10 g/L）和LB/SOB培养基</td></tr><tr><td>Zymolyase（1000 U）</td><td>Zymo Research</td><td>E1004-A</td><td>酵母细胞壁消化以提取质粒（步骤 4.2.2）</td></tr><tr><td>Zymoprep 酵母质粒小提 II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004</td><td>酵母质粒提取；包括溶液1、2、3（步骤4.2）</td></tr><tr><td>ZymoPURE II 质粒中量提取试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4201-B</td><td>中等规模质粒制备；适用于大体积样品的制备</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器与耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性比色皿，1.5 mL</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>用于测量液体培养物的OD600</td></tr><tr><td>锥形瓶，125 mL</td><td>VWR</td><td>10536-912</td><td>预培养与诱导培养</td></tr><tr><td>锥形瓶，250 mL</td><td>VWR</td><td>10536-914</td><td>酵母菌继代培养</td></tr><tr><td>锥形瓶，250 mL</td><td>VWR</td><td>75809-646</td><td>宽口变体</td></tr><tr><td>500 mL 锥形瓶</td><td>VWR</td><td>10536-926</td><td>主预培养烧瓶（步骤 2.3.1、2.4.3）</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>细胞洗涤，整个实验过程中均需离心</td></tr><tr><td>流式细胞分选仪：BD Fusion</td><td>BD 生物科学</td><td>FACSAria Fusion 流式细胞仪（目录编号不适用）</td><td>用于荧光激活细胞分选（FACS）</td></tr><tr><td>Gene Pulser/MicroPulser 电穿孔比色皿，0.2 cm 间隙</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652086</td><td>EBY100电转感受态细胞的电穿孔</td></tr><tr><td>GenePulser Xcell 电穿孔系统</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1652660</td><td>仪器；2.5 kV，25 &amp;mu;F, 200 &amp;Omega; （步骤 2.7.6）</td></tr><tr><td>新不伦瑞克 Innova 40R - 台式轨道摇床</td><td>Eppendorf</td><td>M12990084</td><td>酵母液体培养孵育</td></tr><tr><td>培养皿，100 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>YPD 和 SDCAA 琼脂平板</td></tr><tr><td>SpectraMax QuickDrop 紫外-可见分光光度计</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax QuickDrop</td><td>用于测量液体培养物的OD600和DNA浓度</td></tr><tr><td>Vacufuge plus</td><td>Eppendorf</td><td>2231001204</td><td>用于浓缩 DNA</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva（版本：8.0）</td><td>BD 生物科学</td><td>https://www.bdbiosciences.com/zh-cn/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software</td><td>用于流式细胞仪及应用设置、数据采集和数据分析的工具集合</td></tr><tr><td>Benchling（版本：基于网络的平台，持续更新）</td><td>Benchling, Inc.</td><td>https://www.benchling.com/</td><td>序列设计软件</td></tr><tr><td>SnapGene（版本：8.0.1）</td><td>SnapGene, Inc.</td><td>https://www.snapgene.com/</td><td>序列设计软件</td></tr></tbody></table>

优化的酵母表面展示工作流程用于蛋白酶的定向进化

Optimized Yeast Surface Display Workflow for Directed Evolution of Proteases

定向进化在快速且受控的实验室环境中模拟自然进化过程，以获得具有理想功能或特性的蛋白质。通过筛选大量突变体蛋白质编码基因库，可实现对适用于生物技术、医学和合成生物学应用的所需变异体的功能性选择。利用本方案，我们在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中进行定向进化，以改造蛋白酶变体，使其对非天然底物序列具有高特异性。我们将这些蛋白酶变体展示在酵母细胞表面，从而通过多轮富集的荧光激活细胞分选（FACS）实现对目标变体的筛选。底物盒的四个关键元件与蛋白酶文库共同表达：一个融合蛋白，包含（i）酵母黏附受体亚基Aga2，（ii）筛选和（iii）反向筛选底物序列，（iv）表位标签序列，以及一个可选的内质网（ER）回收信号序列。仅切割了筛选底物序列的酵母细胞，可通过多色FACS结合荧光标记（藻红蛋白/异硫氰酸荧光素标记）的抗表位抗体进行分离。本文提供了开展蛋白酶定向进化实验的优化后逐步操作方案，包括DNA插入片段文库设计和底物盒设计、高效转化（每微克DNA可获得高达109个转化子）的酵母细胞电穿孔、基于FACS的筛选与富集，以及进化变体的测序分析。我们以烟草蚀刻病毒核包含体A蛋白酶（TEVp）为例，演示本定向进化方案，将其底物特异性从天然序列ENLYFQ↓S进化为新序列ENLYFE↓S。

高效的文库构建对于确保突变空间的充分覆盖至关重要。为避免丢失稀有的功能性变异体，转化子的数量应至少达到理论文库大小的10至100倍。由于酿酒酵母（S. cerevisiae）的转化效率受细胞浓度影响，并在对数生长早期至中期达到最高16，我们在电穿孔前优化了初始细胞密度。酵母培养物以初始OD600 值在1.0–4.0范围内进行传代培养，并孵育4小时（n = 2–4次独立的生物学实验），随后将最终的OD600 值映射到酿酒酵母（S. cerevisiae）的生长曲线上，以确认细胞仍处于对数生长中期（图5A，补充图1）。
用4 µg质粒DNA对这些培养物进行电穿孔（n = 2次独立的生物学实验）显示，不同初始OD600条件下转化效率存在显著差异（单因素方差分析，p = 8.92 × 10−7）。与起始OD<s...

本方案提供了利用基于表面展示的选择系统在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中对病毒蛋白酶进行定向进化的优化工作流程。该流程涵盖了DNA插入片段文库和底物盒的设计、适用于高效转化的电穿孔条件、基于荧光激活细胞分选的蛋白酶切割选择，以及富集突变体的测序分析。

定向进化在快速且受控的实验室环境中模拟自然进化过程，以获得具有理想功能的蛋白质或……

optimized-yeast-surface-display-workflow-for-directed-evolution

Research

JoVE Journal

Bioengineering

我们提供了一种详细的方案，用于在酿酒酵母（Saccharomyces...

在Saccharomyces cerevisiae中的定向进化方法：突变文库的构建与筛选

批量处理酵母双杂交筛选可实现多种诱饵蛋白与高度复杂的猎物融合蛋白集合之间相互作用谱的直接比较。本文介绍了优化的方法、新试剂及其在此类筛选中的应用方式。...

一种批量进行的酵母双杂交筛选方法用于比较蛋白质相互作用

本方案描述了进行酵母表面展示筛选实验的关键步骤，以富集能够结合目标抗原的蛋白质变体。...

利用酵母表面展示技术进行蛋白质工程

本文介绍了一种利用酵母表面展示底物进行酶促修饰检测的实验方案。该平台以酪氨酸磷酸酶SHP-2对其某一底物去磷酸化活性的分析为例，展示了典型的酶促修饰检测方法。...

酵母表面展示蛋白的酶法修饰及流式细胞术分析

已开发出一种通用的等离子体光刻技术，可用于生成稳定的表面图案，以引导细胞附着。该技术可用于构建细胞网络，包括模拟天然组织的细胞网络，并已应用于研究多种不同类型的细胞。...

等离子体光刻表面图案化用于构建细胞网络

本方案展示了在定制设计的电趋化室中建立二维和三维环境的方法，可用于追踪细胞 体内/离体 利用单细胞水平的时间延时记录，以研究趋电性（galvanotaxis/electrotaxis）及其他细胞对直流电场（DC...

电场控制下神经前体细胞在二维和三维环境中的定向迁移

介绍一种采用芯片内光聚合技术制备聚合物微阵列的方法。同时描述了利用原子力显微镜、水接触角测量、X射线光电子能谱、飞行时间二次离子质谱以及细胞黏附实验对表面进行高通量表征的过程。...

用于生物材料高通量发现的聚合物微阵列

本文介绍了一种微流控装置的操作方法，该装置可在单个出芽酵母细胞的整个复制和/或时间寿命过程中，实现连续、高分辨率的显微成像。...

芽殖酵母复制性衰老的连续高分辨率显微观察

可生物相容的pH响应型溶胶-凝胶纳米传感器可被整合至聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）电纺支架中。所制备的自报告支架可用于 在 原位...

用于三维细胞培养的自报告支架

三维流动腔装置是一种新型装置 体外...

一种用于研究趋化因子引导细胞在生理流体条件下循环并外渗的新型三维流动腔装置

The University of Texas at Dallas.  该方案为酿 酒 酵母病毒蛋白酶的定向进化提供了优化工作流程，采用基于表面显示的选择系统。报告概述了DNA插入文库和底物盒的设计、优化以实现高转化效率的电穿孔、基于荧光激活的细胞分选以实现蛋白酶切割，以及富集变异的测序。

优化的酵母表面展示工作流程用于蛋白酶的定向进化

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