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Forschungsartikel

Integrative Bulk-, Einzelzell- und räumliche Transkriptomanalysen identifizieren PPARG als potenzielles seneszenzbezogenes prognostisches Gen bei Osteosarkomen

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DOI:

10.3791/73062

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25. September 2026

 ,  ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine Department, Liuzhou People's Hospital, 2Spinal Surgery Department, Liuzhou People's Hospital, 3Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Mithilfe von Bulk-, Einzelzell- und räumlichen transkriptomischen Analysen sowie maschinellen Lernverfahren zur Überlebensmodellierung und experimenteller Validierung stuft diese Studie PPARG als Kandidatengen ein, das mit der Seneszenz in Osteosarkomen assoziiert ist und dessen verminderte Expression mit einem ungünstigen Überleben in TARGET-OS sowie mit vaskulären und mikroumgebungsbezogenen Merkmalen verknüpft ist.

Zusammenfassung

Osteosarkom bleibt bei metastasierendem, rezidivierendem oder therapieresistentem Krankheitsverlauf eine Herausforderung. Ziel dieser Studie war es, seneszenzbezogene prognostische Gene zu identifizieren und ihre räumlichen Kontexte zu charakterisieren. Eine paired-Differenzexpressionsanalyse wurde in GSE99671 mithilfe von DESeq2 durchgeführt und anschließend mit dem CellAge-Seneszenz-Gen-Set geschnitten. Transkriptomische Daten aus dem TARGET-OS-Kollektiv wurden von UCSC Xena bezogen. Kandidatengene wurden mittels univariater Cox-Regression, Kaplan-Meier-Analyse, zeitabhängiger ROC-Analyse (receiver operating characteristic), LASSO-Cox-Regression, wiederholter LASSO-Analyse und Random-Survival-Forest-Modellierung evaluiert, wobei klinische Kovariaten in angepasste Cox-Modelle integriert wurden. Zur Charakterisierung kamen funktionelle Enrichment-Analysen, Analysen der immunen Mikroumgebung, Einzelzell-Transkriptomik, SP_BS3-räumliche Transkriptomik, Expressionsvalidierung in GSE36001 sowie qRT-PCR- und Western-Blot-Validierungen in Osteosarkom-143B-Zellen und Osteoblasten-Zellen zum Einsatz. In GSE99671 waren 2.248 Gene differentiell exprimiert mit einem adjustierten P < 0,05; der Durchschnitt mit den 866 CellAge-Genen ergab 105 seneszenzbezogene differentiell exprimierte Gene. Im TARGET-OS-Kollektiv war ein niedrigerer PPARG-Expressionsgrad mit einem höheren Mortalitätsrisiko assoziiert (univariate HR = 0,603, 95 % KI = 0,454–0,802, P = 0,000494; adjustierte HR = 0,224, 95 % KI = 0,085–0,589, P = 0,00241). Die Hinzunahme von PPARG zum klinischen Modell erhöhte den C-Index von 0,707 auf 0,829. PPARG war in GSE99671 und GSE36001 herunterreguliert, und qRT-PCR sowie Western Blot bestätigten eine niedrigere PPARG-mRNA- und Proteinexpression in Osteosarkom-143B-Zellen im Vergleich zu Osteoblasten-Zellen. Die Einzelzell-Analyse lokalisierte PPARG in endothelialen Zellen, Perizyten, Makrophagen/Monozyten und tumorassoziierten stromalen Zellen. Die räumliche Transkriptomik-Analyse zeigte schwache, aber signifikante positive Korrelationen zwischen der PPARG-Expression und den CellAge-Seneszenz-, endothelialen und perizytenbezogenen Scores. Diese Ergebnisse stellen PPARG als einen vielversprechenden, aus dem CellAge-Set abgeleiteten prognostischen Biomarker in Verbindung mit ungünstigem Überleben und Merkmalen der vaskulären Mikroumgebung beim Osteosarkom vor und unterstützen die Untersuchung seiner potenziellen Relevanz für die Risikostratifizierung und die seneszenzbezogene Tumormikroumgebung. GSE36001 diente lediglich der externen Expressionsvalidierung; eine unabhängige Überlebensvalidierung wurde nicht durchgeführt.

Einleitung

Osteosarkom ist der häufigste primäre bösartige Knochentumor bei Kindern, Jugendlichen und jungen Erwachsenen1. Obwohl die Kombination einer mehrfachen Chemotherapie mit einer Operation die Behandlungsergebnisse bei lokalisiertem Befund verbessert hat2,3, weisen Patienten mit metastasiertem, rezidiviertem oder therapieresistentem Osteosarkom nach wie vor eine schlechte Langzeitüberlebensrate auf3,4. Neuere Erkenntnisse zeigen, dass eine durch oxidativen Stress induzierte epigenetische Umgestaltung die Anpassung an Metastasen und das Tumorwachstum fördern kann, was die komplexe molekulare Plastizität aggressiver Krebsphänotypen unterstreicht5. Zuverlässige Biomarker, die sowohl klinisch interpretierbar als auch biologisch aussagekräftig sind, sind weiterhin begrenzt. Daher bleibt es wichtig, molekulare Merkmale zu identifizieren, die die Heterogenität des Osteosarkoms und das prognostische Risiko über mehrere Datenebenen hinweg erfassen.

Zelluläre Seneszenz ist ein stabiles Programm des Zellzyklusarrests, das durch Dysfunktion der Telomere, DNA-Schäden, oxidativen Stress, Aktivierung von Onkogenen und therapeutischen Druck induziert wird6. Die Seneszenz kann eine fehlerhafte Proliferation einschränken; seneszente Zellen können jedoch auch das Tumormikromilieu durch entzündliche Prozesse, Chemokine, Wachstumsfaktoren und Umbauprogramme der extrazellulären Matrix umgestalten7,8. Bei Osteosarkomen können seneszenzassoziierte Gene sowohl intrinsische Stresszustände der Tumorzellen als auch nicht maligne Kompartimente des Mikromilieus widerspiegeln, doch ihre prognostische Relevanz und räumliche Organisation wurden bisher nicht systematisch untersucht.

PPARG kodiert den proliferator-aktivierten Peroxisomrezeptor gamma, einen ligandenaktivierten nukleären Rezeptor, der an dem Lipidstoffwechsel, der entzündlichen Regulation, der zellulären Differenzierung und der Immunmodulation beteiligt ist9. Die Rolle von PPARG beim Krebs ist kontextabhängig10. In einigen Fällen ist PPARG mit Differenzierung und antiinflammatorischen Zuständen assoziiert, während es in anderen Situationen adaptive Tumor- oder Stromaprogramme unterstützen kann. Dennoch sind sein Expressionsmuster, sein prognostischer Wert sowie seine zelluläre und räumliche Lokalisation im Osteosarkom bislang unvollständig charakterisiert.

In der vorliegenden Studie wurden in GSE99671 differenziell exprimierte Gene identifiziert und mit dem CellAge-Senzenz-Gen-Set überlappt, wodurch 105 seneszenzassoziierte, differenziell exprimierte Gene erhalten wurden. Anschließend wurden TARGET-OS-Überlebensdaten, mehrere Ansätze des maschinellen Lernens und der Überlebensmodellierung sowie eine klinische Anpassung verwendet, um PPARG als Kerngen zu bestimmen. PPARG wurde weiter charakterisiert mittels funktioneller und immunologischer Mikroumgebungsanalysen auf Bulk-Ebene, Einzelzell-Transkriptomik, räumlicher Transkriptomik, externer Expressionsvalidierung aus GSE36001 sowie mittels qRT-PCR und Western Blot in der Osteosarkom-Zelllinie 143B und humanen Osteoblasten.

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Protokoll

Diese Studie verwendete öffentliche Datensätze und Zelllinien zur Analyse und Validierung und umfasste keine menschlichen Probanden oder klinischen Gewebeproben; daher war keine ethische Genehmigung erforderlich.

Differenzielle Expressionsanalyse im Schnittbereich von GSE99671 und CellAge
Rohzähldaten und Informationen zur Probengruppierung für GSE99671 wurden von GEO11,12 bezogen. Achtzehn Paare aus Osteosarkom- und entsprechenden Normalproben wurden analysiert. Die differentielle Expressionsanalyse für gepaarte Stichproben wurde mit DESeq2 unter Verwendung der Designformel ~ pair_id + condition durchgeführt, wobei pair_id die Effekte der gepaarten Individuen berücksichtigte und condition Tumorgewebe mit Normalgewebe verglich13. Gene, die in mindestens drei Proben einen Lesezählwert von mindestens 10 aufwiesen, wurden beibehalten. Differenzielle Expression wurde definiert als adjustierter P < 0,05; für die Visualisierung wurde ein strengerer Schwellenwert von adjustiertem P < 0,05 und |log2FC| ≥ 1 angewandt. Die differentiell exprimierten Gene wurden mit den 866 CellAge-Senescenzgenen nach Umwandlung der Gensymbole in Großbuchstaben geschnitten14. Die differentielle Expressionsanalyse wurde in R (Version 4.3.2) mit DESeq2 (Version 1.40.2) durchgeführt, und die adjustierten P-Werte wurden nach der Methode von Benjamini-Hochberg berechnet.

Kohorte TARGET-OS und prognostische Modellierung
Transkriptomische und klinische Daten der TARGET-OS-Kohorte wurden von UCSC Xena15 bezogen. Es wurden Expressionswerte für die 105 seneszensbezogenen differentiell exprimierten Gene extrahiert. In die Analyse eingeschlossen wurden 85 Patienten mit vollständigen Angaben zur Überlebenszeit, Überlebensstatus und Genexpressionsdaten der Kandidatengene, darunter 27 Todesfälle. Standardisierte Genexpressionswerte wurden mittels univariater Cox-Regression16, Kaplan-Meier-Überlebensanalyse und zeitabhängiger ROC-Analyse (Receiver Operating Characteristic)17 ausgewertet. Zur Beurteilung der Stabilität der Variablenauswahl und der Variablenwichtigkeit kamen LASSO-Cox-Regression18, wiederholte LASSO-Stabilitätsanalyse und Random-Survival-Forest-Modellierung zum Einsatz19. Der integrierte Hub-Score und das klinisch integrierte Rangverfahren wurden anhand der unten detaillierten binären Kriterien berechnet. Die Überlebensanalysen wurden in R mit den Paketen survival (Version 3.5-7), timeROC (Version 0.4), glmnet (Version 4.1-8) und randomForestSRC (Version 3.2.2) durchgeführt. Bei der univariaten Cox-Vorauswahl der 105 Kandidatengene wurde eine Falsch-Entdeckungs-Rate (FDR)-Korrektur nach Benjamini-Hochberg angewandt; Gene mit einem FDR < 0,05 galten als statistisch signifikant.

Modell-Vorverarbeitung, PPARG-Gruppierung und zeitabhängige ROC-Analyse
Von 85 Patienten mit 27 Todesfällen wurden Gene mit Null-Varianz ausgeschlossen, fehlende Werte der Expression von Kandidatengenen wurden medianimputiert, und die Expression jedes Kandidatengens wurde anhand des Z-Scores standardisiert. Für die Kaplan-Meier-Analyse wurde die Expression am Median der Kohorte dichotomisiert: Werte streng oberhalb des Medians wurden der Gruppe mit hoher Expression zugeordnet, Werte am oder unterhalb des Medians der Gruppe mit niedriger Expression (PPARG: n = 42 hoch und n = 43 niedrig). Log-Rank-Tests waren zweiseitig. Zeitabhängige ROC-Analysen verwendeten timeROC mit Ereignisursache = 1, marginaler inverser Wahrscheinlichkeitsgewichtung bei Zensierung, Evaluierungszeitpunkten von 365, 1.095 und 1.825 Tagen sowie iid = FALSE. Um sicherzustellen, dass größere Markerwerte durchgängig ein höheres Risiko anzeigen, wurden standardisierte Expressionswerte für Gene mit positiven Cox-Koeffizienten verwendet und für schützende Gene mit negativen Koeffizienten mit -1 multipliziert.

LASSO und wiederholtes LASSO
Cox-LASSO wurde mit glmnet unter Verwendung von family = "cox", alpha = 1, vorheriger z-Score-Standardisierung (daher standardize = FALSE), fünffacher Kreuzvalidierung, type.measure = "deviance" und Zufallsstartwert 123 angepasst. Die primäre Koeffizientenlösung verwendete lambda.min. Die Stabilitätsanalyse wiederholte dieselbe fünffache Kreuzvalidierung 300-mal; Wiederholung b verwendete den Startwert 1000 + b (b = 1,...,300). Für jedes Gen war die Selektionshäufigkeit der Anteil der Wiederholungen mit einem von null verschiedenen Koeffizienten bei lambda.min; eine von null verschiedene Selektion bei lambda.1se wurde ebenfalls erfasst.

Zufallswald für Überlebensanalysen
Ein Überlebenswald wurde mit randomForestSRC (Version 3.2.2) an alle 105 standardisierten Kandidatengene angepasst, unter Verwendung von seed 123, ntree = 1.000, importance = TRUE und na.action = „na.impute“. Die Paketstandardeinstellungen für Überlebensdaten wurden beibehalten: log-rank-Teilung, mtry = 11 (Aufrundung der Quadratwurzel aus 105 Prädiktoren), minimale Endknotengröße = 15, nsplit = 10 zufällige Teilungspunkte, Stichprobenziehung ohne Zurücklegen mit einem Stichprobenanteil von 0,632 und Anti-Split-Variablenwichtigkeit.

Integrierter Hub-Score
Jedes der 105 differentiell exprimierten Kandidatengene aus der CellAge-Liste erhielt einen Punkt für jedes der sechs binären Kriterien: (1) Zugehörigkeit zum Schnittbereich differentielle Expression/CellAge (alle Kandidaten erhielten diesen Punkt, da ein adjustierter P < 0,05 vor der Bewertung erforderlich war); (2) nomineller univariater Cox-P < 0,05; (3) Kaplan-Meier Log-Rank-P < 0,05; (4) mittlere zeitabhängige AUC über 3 und 5 Jahre ≥ 0,65; (5) Selektionshäufigkeit bei wiederholter LASSO-Regression (lambda.min) auf oder über dem 70. Perzentil im Vergleich zu allen Kandidaten und > 0; und (6) Wichtigkeit im Random-Survival-Forest-Modell auf oder über dem 70. Perzentil im Vergleich zu allen Kandidaten und > 0. Alle Kriterien hatten ein gleiches Einheitsgewicht, wodurch sich ein Hub-Score zwischen 0 und 6 ergab; Gene mit einem Score von ≥ 4 wurden zur klinischen Anpassung weitergeleitet (18 Gene). Auch die univariaten Cox-FDR-Werte wurden angegeben, und FDR < 0,05 wurde zur Kennzeichnung von Signifikanz unter Berücksichtigung des multiplen Testens verwendet, doch der vorab festgelegte Bewertungsindikator basierte auf nominellem P < 0,05.

Klinisch-integrierte Rangliste
Nach der Zusammenführung von Expressions- und klinischen Daten umfassten die angepassten Analysen 40 Patienten mit vollständigen Kovariabildatensätzen und 13 Todesfälle. Die endgültige Punktzahl ergab sich aus der anfänglichen Hub-Punktzahl zuzüglich eines Punktes für jedes der sieben Kriterien: angepasster Cox P < 0,05, angepasster Cox P < 0,10, Sensitivitäts-Cox P < 0,05 nach Ausschluss definitiver Chirurgie, Sensitivitäts-Cox P < 0,10, mittlere AUC für 3 und 5 Jahre ≥ 0,65, Likelihood-Quotienten-Test P < 0,10 für das Modell mit klinischen Parametern plus Gen im Vergleich zum rein klinischen Modell und Delta AIC < 0. Da die Schwellenwerte 0,05 und 0,10 ineinander geschachtelt waren, trug ein P < 0,05 zwei Punkte ein, wodurch eindeutig signifikante angepasste und Sensitivitäts-Cox-Ergebnisse stärker gewichtet wurden. Die Gesamtpunktzahl reichte von 0 bis 13; Gleichstände wurden zuerst durch den niedrigeren angepassten Cox-P-Wert, danach durch die höhere mittlere AUC für 3 und 5 Jahre aufgelöst. PPARG erhielt alle sechs anfänglichen Punkte sowie alle sieben Punkte für die klinische Integration (13/13) und belegte damit den ersten Platz. Die Verbesserung des C-Index wurde beschreibend angegeben und nicht in die Punktbewertung einbezogen.

Klinische Anpassung
Kandidaten-Hub-Gene wurden mit klinischen Variablen aus TARGET-OS integriert, einschließlich Geschlecht, Alter, Krankheitsstatus bei Diagnosestellung, primärer Tumorsitz, spezifischer Tumorbereich und definitive Chirurgie. In die klinisch angepassten Analysen gingen 40 Patienten mit vollständigen Expressions- und klinischen Daten, darunter 13 Todesfälle, ein. Cox-Modelle, die nur klinische Variablen enthielten, wurden mit Modellen verglichen, die zusätzlich die Genexpression berücksichtigten. C-Index, Akaike-Informationskriterium (AIC) und P-Werte des Likelihood-Quotienten-Tests wurden zur Bewertung der Modellverbesserung herangezogen. Eine Sensitivitätsanalyse wurde nach Entfernung der Variablen „Chirurgie“ durchgeführt.

Funktionelle Anreicherung und Analyse der Immunmikroumgebung
TARGET-OS-Proben wurden entsprechend der PPARG-Expression stratifiziert. Die differentielle Expression zwischen den PPARG-hoch- und PPARG-niedrig-Gruppen wurde verwendet, um sortierte Genlisten für die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA)20 zu erstellen. Die dargestellten Signalwege waren: Nemeth Inflammatory Response LPS Up, Burton Adipogenesis 5, Burton Adipogenesis 6, Krieg KDM3A Targets Not Hypoxia, Reactome: Transcriptional Regulation By TP53, Fulcher Inflammatory Response Lectin Vs LPS Dn, Hollmann Apoptosis Via CD40 Dn, Zhou Inflammatory Response Live Dn, WP: Fatty Acids And Lipoproteins Transport In Hepatocytes, Sweet Lung Cancer KRAS Up, KEGG Medicus Pathogen HIV Tat To TLR2/4 NF-kB Signaling Pathway und Reactome: Fatty Acids. Ein aggregierter CellAge-Senescenz-Score wurde berechnet, und eine Spearman-Korrelationsanalyse wurde verwendet, um Assoziationen zwischen PPARG und Seneszenzgenen oder Signaturen der Immunmikroumgebung zu bewerten21. Unterschiede in den Mikroumgebungsscores zwischen den PPARG-hoch- und PPARG-niedrig-Gruppen wurden mittels nichtparametrischer Tests mit Korrektur für Mehrfachvergleiche ausgewertet.

Einzelzell-Transkriptom-Analyse
Ein veröffentlichter Einzelzell-Transkriptom-Datensatz von menschlichem Osteosarkom wurde mithilfe eines vorverarbeiteten Objekts analysiert, für das bereits Qualitätskontrolle, Dimensionsreduktion, Clusterung und manuelle Annotation durchgeführt worden waren22,23,24. Insgesamt wurden 68.336 Zellen und 32.297 Gene berücksichtigt. Zur Interpretation im Haupttext wurden die Annotationen auf 13 Hauptzelltypen vereinfacht: B-Zellen, CAFs, proliferierende Zellen, endotheliale Zellen, erythroide Zellen, Makrophagen/Monozyten, maligne Osteosarkomzellen, myogene Zellen, Neutrophile, osteoklastenähnliche Zellen, Perizyten, T/NK-Zellen und tumorassoziierte stromale Zellen. Zur Visualisierung der Lokalisation von PPARG wurden Dimensionsreduktionsdarstellungen, Darstellungen der Merkmalsexpression, Punkt- und Violin-Plots verwendet. PPARG-positive Zellen wurden als Zellen definiert, deren Expression größer als null war. Unterschiede zwischen den Zelltypen wurden mittels Kruskal-Wallis- und Wilcoxon-Rangsummentests mit Benjamini-Hochberg-Korrektur bewertet. Die Einzelzell-Analysen wurden in R mit Seurat (Version 5.0.1) durchgeführt.

Räumliche transkriptomische Analyse
Die räumliche Transkriptomik-Probe SP_BS3 wurde verwendet, um ein räumliches Expressionsobjekt zu konstruieren25,26. Die Qualitätskontrollschwellenwerte waren nFeature_Spatial ≥ 200 und percent.mt ≤ 30, wodurch 4.572 Spots für die Analyse verblieben. Die Daten wurden normalisiert, 3.000 hochvariable Gene ausgewählt, und anschließend wurden Datenskalierung, Hauptkomponentenanalyse, Konstruktion eines Nachbarschaftsgraphen, räumliche Spots-Clustern und Dimensionsreduktion durchgeführt. Eine räumliche CellAge-Senescenz-Score wurde berechnet, nachdem PPARG aus dem Gen-Set entfernt worden war, um eine zirkuläre Korrelation zu vermeiden. Endotheliale, perizytäre, Makrophagen/Monozyten-, tumorassoziierte stromale, maligne Osteosarkom- und osteoklastenähnliche Signaturen wurden konstruiert und bewertet. Die Spearman-Korrelationsanalyse wurde verwendet, um Assoziationen zwischen der PPARG-Expression und den räumlichen Scores zu untersuchen. Eine Label-Übertragung wurde unter Verwendung des Einzelzell-Datensatzes als Referenz und des räumlichen Datensatzes als Abfrage durchgeführt, um vorhergesagte Zelltyp-Scores für jeden Spot abzuleiten23,24. Die räumlichen transkriptomischen Analysen wurden in R mit Seurat (Version 5.0.1) durchgeführt, und eine FDR-Korrektur nach Benjamini-Hochberg wurde auf alle räumlichen Korrelations-P-Werte angewendet.

Externe Expressionsvalidierung in GSE36001
Der GEO-Datensatz GSE36001 wurde ausschließlich als unabhängige Kohorte zur Expressionsvalidierung verwendet; da Überlebensdaten nicht verfügbar waren, erfolgte keine prognostische Validierung11,27. Der Datensatz umfasste 19 Osteosarkom-Proben und sechs normale Kontrollproben. Die Plattformanmerkung GPL6102 wurde verwendet, um Sondenidentifikatoren in Gensymbole umzuwandeln. Wenn mehrere Sonden auf dasselbe Gen abgebildet wurden, blieb die Sonde mit der höchsten durchschnittlichen Expression erhalten. Die differentielle Expression zwischen Tumor- und Normalgruppen wurde mittels limma28 bewertet. Die Analysen wurden in R mit limma (Version 3.56.2) durchgeführt, und angepasste P-Werte wurden nach der Methode von Benjamini-Hochberg berechnet.

qRT-PCR- und Western-Blot-Validierung
Die experimentelle Validierung wurde unter Verwendung der humanen Osteosarkom-Zelllinie 143B und humaner Osteoblasten-Zellen durchgeführt. Die Osteosarkom-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit 10 % fetalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin, bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO₂ kultiviert und bei 80–90 % Konfluenz mit 0,25 % Trypsin-EDTA passagiert. Die humanen Osteoblasten-Zellen wurden unter den empfohlenen Kulturbedingungen gehalten. Alle Zelllinien wurden auf Mykoplasmakontamination überprüft und als frei davon bestätigt. Für die qRT-PCR wurde die Gesamt-RNA mit einem auf Phenol-Guanidinium basierenden RNA-Extraktionsreagenz isoliert, und die RNA-Konzentration sowie -reinheit wurden spektrophotometrisch bestimmt. Ein Mikrogramm Gesamt-RNA wurde gemäß der empfohlenen Anleitung mit einem Reagenz für die Reverse Transkription transkribiert. Die qRT-PCR wurde mittels einer fluoreszenzbasierten DNA-Bindungs-Färbemethode unter folgenden Zyklierungsbedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 30 s, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 5 s und 60 °C für 30 s, sowie einer Schmelzkurvenanalyse zur Bestätigung der Amplifikationsspezifität. Jede Probe wurde technisch dreifach durchgeführt, und es wurden drei unabhängige biologische Experimente durchgeführt. GAPDH diente als interne Kontrolle, und die relative PPARG-Expression wurde nach der 2-ΔΔCt-Methode29 berechnet. Der PPARG-Forward-Primer lautete 5'-CGAAGACATTCCATTCACAAGAACAG-3', der Reverse-Primer 5'-AGATGCAGGCTCCACTTTGATTG-3'.

Die Western-Blot-Analyse wurde zur Untersuchung der PPARG-Proteinexpression durchgeführt. Die Zellen wurden in Radioimmunpräzipitationspuffer, ergänzt mit Proteaseinhibitoren, lysiert und die Protein-konzentrationen mittels Bicinchoninsäure-Assay bestimmt. Gleiche Mengen an Protein (30 µg pro Lane) wurden mittels 10%iger Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und auf Polyvinylidenfluorid-Membranen übertragen. Nach der Blockierung mit 5%iger fettfreier Milch für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen PPARG (1:1.000) und GAPDH (1:5.000), gefolgt von der Inkubation mit einem mit Peroxidase konjugierten sekundären Antikörper (1:5.000) für 1 h bei Raumtemperatur. Proteinbande wurden mittels Chemilumineszenzdetektion sichtbar gemacht, und es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt. Die Bandenintensitäten wurden mithilfe einer Bildanalyse-Software quantifiziert30. Zwischengruppenunterschiede wurden mit dem zweiseitigen ungepaarten t-Test von Student analysiert t Tests. Die Daten wurden als Mittelwert dargestellt ± Standardabweichung (SD) aus drei unabhängigen Experimenten und P < Ein p-Wert von 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die statistischen Analysen der experimentellen Daten wurden mit einer statistischen Analyse-Software (Version 9.0) durchgeführt.

Statistische Analyse
Sofern nicht anders angegeben, wurden alle bioinformatischen Analysen in R (Version 4.3.2) durchgeführt. Zweiseitig P Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet. Die Korrelationen wurden mittels des Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman bewertet (ρ). Bei Bedarf wurde eine Korrektur für Mehrfachvergleiche mit der Benjamini-Hochberg-FDR-Methode durchgeführt. Experimentelle Daten wurden als Mittelwert dargestellt ± SD und wurden mit einem zweiseitigen ungepaarten Student’s-t-Test verglichen t Tests. Die experimentellen statistischen Analysen wurden mit statistischer Analyse-Software (Version 9.0) durchgeführt.

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Ergebnisse

GSE99671 identifizierte 105 CellAge-Senescenz-bezogene differentiell exprimierte Gene
GSE99671 umfasste 36 Proben aus 18 gepaarten Geweben. Nach Filterung von Genen mit geringer Expression blieben 16.683 Gene erhalten. Bei einem adjustierten P < 0,05 waren 2.248 Gene differentiell exprimiert. Unter der strengeren Schwelle eines adjustierten P < 0,05 und |log2FC| ≥ 1 waren 594 Gene signifikant, darunter 102 hochregulierte und 492 herunterregulierte Gene in Tumoren (

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Diskussion

In dieser Studie wurde PPARG durch Integration einer differentiellen Expressionsanalyse, eines Zellalterungs-Gen-Intersektionsansatzes (CellAge), einer Überlebensmodellierung mittels TARGET-OS, klinischer Adjustierung, multi-omischer Lokalisierung und experimenteller Validierung als Kandidatengen für seneszenzbezogene Prognose bei Osteosarkom identifiziert. Dieses analytische Vorgehen entspricht dem gegenwärtigen Fokus molekular basierter Osteosarkom-Forschung sowie der Nutzung kuratierter Ressourcen zu Seneszengenen zur...

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Offenlegungen

Die Autoren geben keine Wettbewerbsinteressen an.

AUTORENBEITRÄGE:
Yongwen Li und Wentao Qin haben die Studie konzipiert und entworfen. Yongwen Li führte die bioinformatischen und computergestützten Analysen durch. Tuo Liang führte die experimentelle Validierung durch. Rubiao Qiu und Zide Zhang leisteten Beiträge zur Abbildungserstellung. Rubiao Qiu und Zide Zhang leiteten die Studie und überarbeiteten den Artikel kritisch. Alle Autoren haben den Endentwurf des Manuskripts geprüft und genehmigt.

Danksagungen

Die Autoren danken den beteiligten Wissenschaftlern und Beiträgen der Projekte GEO, TARGET-OS, UCSC Xena, CellAge, MSigDB und des menschlichen Osteosarkom-Single-Cell- und räumlichen Transkriptomatlas für die Bereitstellung öffentlich zugänglicher Datensätze und Ressourcen, die diese Studie ermöglichten. Diese Arbeit wurde von der Guangxi Natural Science Foundation (Nr. 2023GXNSFAA026111) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Primärantikörper gegen GAPDHProteintech Group, Wuhan, China10494-1-APPrimärantikörper zur Detektion von GAPDH als Ladekontrolle in der Westernblot-Analyse; Verdünnung 1:5.000.
Primärantikörper gegen PPARGProteintech Group, Wuhan, China16643-1-APPrimärantikörper zur Detektion des PPARG-Proteins mittels Westernblot; Verdünnung 1:1.000.
BCA-Proteinassay-KitBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaPC0020Farbmessverfahren zur Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration vor der Elektrophorese.
DESeq2BioconductorVersion 1.40.2R-Paket zur differentiellen Genexpressionsanalyse von zählbasierten transkriptomischen Daten.
Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China11995Grundlegendes Kulturmedium zur Kultivierung von 143B-Osteosarkomzellen.
ECL-DetektionsreagenzBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaPE0010Chemilumineszenter Substrat zur Detektion von HRP-konjugierten Antikörpern in der Westernblot-Analyse.
Fetales Kälberserum (FBS)Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd. (Sijiqing), Huzhou, Zhejiang, China11011-8611Serumzusatz, der dem Kulturmedium hinzugefügt wird, um Zellwachstum und -lebensfähigkeit zu unterstützen.
glmnetCRANVersion 4.1-8R-Paket zur penalisierten Regressionsanalyse, einschließlich LASSO- und Elastic-Net-Modellierung.
GraphPad PrismGraphPad Software, San Diego, CA, USAVersion 9.0Software zur statistischen Analyse, Erstellung von Grafiken und Visualisierung experimenteller Daten.
HRP-konjugierter sekundärer AntikörperProteintech Group, Wuhan, ChinaSA00001-2Sekundärantikörper, konjugiert mit Rettichperoxidase (HRP), zur Detektion in der Westernblot-Analyse; Verdünnung 1:5.000.
Menschliche OsteoblastenCell Applications, Inc., San Diego, CA, USA406-05APrimäre humane Osteoblasten, verwendet als nicht maligne Vergleichs- bzw. Kontrollzelllinie.
Menschliche Osteosarkom-143B-ZelllinieAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USACRL-8303Menschliche Osteosarkom-Zelllinie, verwendet für in-vitro-Validierungsversuche und molekulare Assays.
ImageJNational Institutes of Health (NIH), USAVersion 1.53Bildanalyse-Software zur quantitativen Auswertung experimenteller Bilder.
limmaBioconductorVersion 3.56.2R-Paket zur differentiellen Expressionsanalyse und statistischen Tests basierend auf linearen Modellen.
Penicillin-StreptomycinBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaP1400Antibiotischer Zusatz im Zellkulturmedium zur Verringerung bakterieller Kontamination.
PPARG- und GAPDH-PrimerSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai, ChinaIndividuelle Synthese; Sequenzen sind in der Methodik angegebenIndividuell hergestellte Oligonukleotid-Primer zur qPCR-Analyse der Expression von PPARG und GAPDH.
PVDF-Membranen, 0.45 µmBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaYA1701Membranen zur Proteinübertragung während der Westernblot-Analyse.
R-StatistiksoftwareR Foundation for Statistical Computing, Wien, ÖsterreichVersion 4.3.2Statistische Rechenumgebung zur Durchführung bioinformatischer Analysen, Modellbildung und Visualisierung.
randomForestSRCCRANVersion 3.2.2R-Paket zur Modellierung mittels Random-Survival-Forest und zur Analyse der Merkmalswichtigkeit.
Reverse-Transkriptions-KitBeyotime Biotech Inc., Shanghai, ChinaD7168MWird zur Synthese von komplementärer DNA (cDNA) aus isolierter RNA vor der quantitativen PCR verwendet.
RIPA-LysepufferBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaR0010Puffer zur Proteinextraktion, verwendet zum Lyse von Zellen für die Westernblot-Analyse.
SeuratSatija LaboratoryVersion 5.0.1R-Paket zur Verarbeitung, Integration, Clusterung und Visualisierung von Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten.
survivalCRANVersion 3.5-7R-Paket zur Überlebenszeitanalyse, einschließlich Cox-Proportional-Hazards-Modellierung.
SYBR-Green-qPCR-MastermixBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaSR1110Fluoreszierender Mastermix zur quantitativen Echtzeit-PCR-Amplifikation.
timeROCCRANVersion 0.4R-Paket zur Erstellung zeitabhängiger ROC-Kurven und zur Berechnung der Vorhersagegenauigkeit über die Zeit.
TRIzol-ReagenzInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15596026CNReagenz zur Extraktion der Gesamt-RNA aus kultivierten Zellen.
Trypsin-EDTA, 0,25 %Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaT1300Zell-Dissociationsreagenz zur Passagierung und Gewinnung adhärenter Zellen.

Referenzen

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