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</ol>

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP-Mix</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>PCR-Reaktionen (Tabellen 1, 3)</td></tr><tr><td>10X PBS, pH 7,4</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>Färbepufferbasis (Schritte 3.2&ndash;3.3)</td></tr><tr><td>5X Q5-Reaktionspuffer</td><td>NEB</td><td>B9027S</td><td>Wird separat verkauft; auch in Q5-Polymerase enthalten</td></tr><tr><td>Agar, Bacto</td><td>BD Difco</td><td>281230-500g</td><td>SDCAA-Agarplatten (Tabelle 5); 15 g/L</td></tr><tr><td>Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Gelelektrophorese</td></tr><tr><td>Anti-FLAG PE-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>637309</td><td>FACS-Färbung; PE-konjugiertes anti-FLAG</td></tr><tr><td>Anti-HA-Tag-Antikörper [FITC]</td><td>GenScript</td><td>A01621</td><td>FACS-Färbung; FITC-konjugiertes anti-HA</td></tr><tr><td>Bacto Casaminosäuren</td><td>BD Difco</td><td>223120</td><td>SDCAA+, SGCAA+, SCAA-Medien (Tabelle 5); 5 g/L</td></tr><tr><td>Bacto Pepton / Trypton</td><td>RPI</td><td>T60060-10000.0</td><td>LB/SOB-Medienzubereitung; 20 g/L in YPD (Tabelle 5)</td></tr><tr><td>BSA, bovines Serumalbumin, Fraktion V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126575-10GM</td><td>0,5% in PBS; Färbepuffer (Schritte 3.2&ndash;3.3)</td></tr><tr><td>BsmBI-v2 (200 U)</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td>Golden Gate-Assembly des Substratkassetten (Tabelle 8)</td></tr><tr><td>Calciumchloridlösung (1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100mL</td><td>Elektroporationspuffer: 1 mM Endkonzentration (Tabelle 5)</td></tr><tr><td>ColiRollers&reg; Plattenbeads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71013-3</td><td>Sterilisiere durch Einlegen in Reagenzflaschen und Autoklavieren bei 121&ordm;C, 15 psi, für 15 Min.</td></tr><tr><td>D-Galaktose</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12813.30</td><td>250 g; 20% w/v-Vorrat für SGCAA+-Induktion (Tabelle 5)</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Thermo Fisher</td><td>1327300.10</td><td>Elektroporationspuffer (1 M) und Auswuchsmedium (Tabelle 5)</td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glukose), wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>YPD, SDCAA+, 20% w/v Dextrose-Vorrat (Tabelle 5)</td></tr><tr><td>Difco Hefennierstoffbasis ohne Aminosäuren</td><td>Sigma</td><td>Y0626-250G</td><td>6,7 g/L in SDCAA/SGCAA (Tabelle 5)</td></tr><tr><td>Difco YPD-Bouillon (vorgemischt)</td><td>BD</td><td>242820-500g</td><td>Vorgefertigte YPD-Alternative; 500 g</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Konditierungspuffer: 10 mM Endkonzentration; 250 &mu;L aliquotieren, bei -20&deg;C lagern</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. CyclePure PCR-Reinigungskit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6492-02</td><td>PCR-Produktreinigung</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Gel-Extraktionskit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D2500-01</td><td>Gelreinigung nach PCR und Restriktionsverdau (Schritte 1.1.8, 1.3.2)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid-DNA-Mini-Kit I</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6942-02</td><td>Plasmidreinigung (Schritt 4.2)</td></tr><tr><td>Glycerol (&ge;99%)</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td>50% v/v-Vorrat für Glycerinvorräte (Schritt 4.1.1)</td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>SDCAA+ und SGCAA+: 50 &mu;g/mL Endkonzentration; ersetzt Sigma K0879-5G</td></tr><tr><td>KLD-Enzymmix</td><td>NEB</td><td>M0554S</td><td>Kinase-Ligase-DpnI; zielgerichtete Mutagenese</td></tr><tr><td>KLD-Reaktionspuffer</td><td>NEB</td><td>B0554A</td><td>Verwendet mit KLD-Enzymmix</td></tr><tr><td>LB-Bouillon (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td>E. coli-Flüssigkultur</td></tr><tr><td>Lithiumacetatdihydrat (LiOAc&middot;2H2O)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A17921.30</td><td>Konditierungspuffer: 0,1 M Endkonzentration; vor DTT hinzufügen (Tabelle 5)</td></tr><tr><td>Luria-Agar (Luria-Bertani-Agar)</td><td>RPI</td><td>L24020-2000.0</td><td>E. coli-Bebrütung; ersetzt Sigma LB-Agar Lennox L2897-1KG</td></tr><tr><td>OmniPur Casaminosäuren</td><td>Sigma</td><td>2240-500GM</td><td>Alternative Casaminosäurenquelle</td></tr><tr><td>pDD1523</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP</td></tr><tr><td>pDD1524</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>SDCAA+, SGCAA+: 1X Endkonzentration</td></tr><tr><td>PstI-HF (5000 U)</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td>Vektorlinearisierung (Tabelle 10); HF-Version verwenden</td></tr><tr><td>Q5 HF DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Hochtreue Polymerase; Alternative zu Q5 Hot Start</td></tr><tr><td>Q5 High GC Enhancer</td><td>NEB</td><td>B9028A</td><td>Für PCR-Reaktionen mit hohem GC-Gehalt</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start DNA-Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>PCR-Assembly und -Amplifikation (Tabellen 1, 3)</td></tr><tr><td>rCutSmart-Puffer (10X)</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Liegt PstI-HF und SphI-HF bei (Tabelle 10)</td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>NEB</td><td>R3138L</td><td>Zusätzliches Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>SOC-Medium</td><td>NEB</td><td>B902

optimierter workflow zur anzeige von hefeoberflächen für die gerichtete entwicklung von proteasen

Optimized Yeast Surface Display Workflow for Directed Evolution of Proteases

Optimierter Workflow zur Anzeige von Hefeoberflächen für die gerichtete Entwicklung von Proteasen

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Research

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Bioengineering

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