Name: מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: למדו כיצד לבצע הקלטות patch-clamp מרובות-אלקטרודים בסיוע מחשב עד ל-12 תאים במצב whole cell. שיטה זו מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של תכונות רשתות עצביות קטנות במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו רוצים להודות לגלעד זילברברג, מישל Pignatelli, תומאס ק ברגר, לוקה Gambazzi, וסוניה גרסיה לייעוץ רב ערך על שיפורים לאוטומציה הליך תיקון מהדק. אנו מודים Rajnish ראנג&#39;אן לקבלת ייעוץ וסיוע ביישום תוכנה יקרים. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי האיחוד האירופי בפרויקט סינפסה ובחלקו על ידי התכנית למדע הגבולות האנושי.

<ol><li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473(2010).</li>
<li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense%2C+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons%3A+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network%3A+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li>
<li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single%2C+Genetically+Targeted+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003(2011).</li>
<li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLM+Microscopy%3A+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שאלה מיידית שעולה בדרך כלל בדבר שיעור הצלחה של ההליך שתארנו מ. לשיעורי הצלחה גבוהים הכנה היא חיונית. טפטפות חייבת להיות פתחי קצה שנחשבים כמספיקים לאדם התאים שנרשם. סינון הפתרון תאיים, כדי למנוע טפטפות הסתומה הוא גם חשוב. טפטפות מאוד נקייה, טרי משכה הן דרישה אחרת. התפלגות הבינומית היא הדגם הפשוט ביותר שניתן להשתמש בם כדי להבין כיצד נושאים אלה משפיעים על התשואה הסופית. זה סביר לצפות הנסיין עם ניסיון וציוד מתאים כדי להשיג שיעור הצלחה של 80% או יותר בהקלטת נוירונים בודדים עם משוב חזות...

היכולת להקליט ולעורר מספר אתרים עם דיוק מיקרומטר היא מאוד שימושית עבור ניסוי השגת הבנה טובה יותר של מערכות עצביות. טכניקות רבות פותחו למטרה זו אבל אף מאפשרות הרזולוציה submillivolt מושגת על ידי טכניקת תיקון מהדק, חיונית ללימוד פעילות התת ופוטנציאלי postsynaptic בודדים. כאן אנו מכסים את פיתוחה של מערכת התיקון-clamp שנתי עשר האלקטרודה בעזרת מחשב שמטרתה הקלטה בו זמנית ומגרה מספר רב של תאים בודדים בדייקנות מספיק ללימוד קישוריות עצבית. אמנם יכולים להיות יזום יישומים רבים אחרים למערכת כזו, זה משאיל את עצמו במיוחד גם ללימוד קישוריות הסינפטית בהתחשב בעובדה שמספר חיבורים אפשריים בתוך קבוצה של נוירונים גדל באופן פרופורציונלי לריבוע מספר הנוירונים בשאלה. לכן, בזמן שמערכת עם שלוש אלקטרודות מאפשרת בדיקהמופע של עד שישה חיבורים ולרוב הקלטה אחת, הקלטת עשרה נוירונים מאפשר בדיקת ההתרחשות של עד 132 קשרים ולעתים קרובות התבוננות למעלה מתריסר (איור 1). התצפית של עשרות חיבורים בו זמנית מאפשרת לנתח את הארגון של רשתות קטנות ולהסיק מאפיינים סטטיסטיים של מבנה הרשת שלא יכול להיות נחקר אחר 1. יתר על כן, גירוי מדויק של תאים רבים גם מאפשר כימות של גיוס של תאי postsynaptic 2.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX51WI</td><td>40X מניפולטורים אובייקטיביים טבילה</td></tr><tr><td></td><td>Luigs Neumann</td><td>SM-5</td><td>פרוטוקול טורי בשימוש</td></tr><tr><td>מגברים</td> מכשירי <td>אקסון</td><td>MultiClamp 700B</td><td>SDK משומש</td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>עד פוטוניקה</td><td>VS 55</td><td>BNC פלט אנלוגי</td></tr><tr><td>תופס מסגרת</td><td>תרגום נתונים</td><td>DT3120</td><td>SDK בשימוש</td></tr><tr><td>אוסצילוסקופים</td><td>Tektronix</td><td>TDS 2014</td><td>תקשורת טורית</td></tr><tr><td>רכישת נתונים</td><td>InstruTECH</td><td>ITC 1600</td><td></td></tr><tr><td>רכישת נתונים</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6221</td><td>ספרייה בשימוש (.dll)</td></tr> <tr><td>שסתום לחץ</td><td>SMC</td><td>SMC070C-6BG-32</td><td></td></tr><tr><td>חיישן לחץ</td><td>Honeywell</td><td>24PCDFA6G</td><td></td></tr><tr><td>ממברנה משאבת</td><td>Schego</td><td>אופטימלית</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת תיקון מהדק multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

טכניקת התיקון-clamp היא כיום השיטה הכי המבוססת היטב להקלטת פעילות חשמלית מנוירונים בודדים או תאי subcellular שלהם. עם זאת, להשגת הקלטות יציבה, גם מהתאים בודדים, נותר הליך מורכב למדי זמן רב. אוטומציה של שלבים רבים בשילוב עם תצוגת מידע יעילה יכולה מאוד לסייע experimentalists בביצוע מספר רב יותר של הקלטות עם אמינות גבוהה יותר ובפחות זמן. על מנת להשיג את הקלטות בקנה מידה גדולה שסכמנו את הגישה היעילה ביותר היא לא automatize באופן מלא בתהליך, אבל כדי לפשט את הצעדים הניסיוניים ולהפחית את הסיכוי לטעויות אנוש תוך שילוב ניסיונו של הנסיין ומשוב חזותי ביעילות. עם מטרות אלה בחשבון שפיתחנו מערכת ממוחשבת המרכזת את כל הבקרות הנדרשות לניסוי רב האלקטרודה תיקון מהדק בממשק יחיד, commercgamepad האלחוטי זמין ially, תוך הצגה ברמזי מידע והדרכה ניסוי קשורות במסך המחשב. כאן אנו מתארים את המרכיבים השונים של המערכת שאפשרה לנו להפחית את הזמן הנדרש להשגת את תצורת ההקלטה ולהגדיל באופן משמעותי את הסיכוי להקלטה בהצלחה מספר גדול של תאי עצב בו זמנית.

בעקבות השיטות שתוארו לעיל הצלחנו בביצוע הקלטת כל התא של עד שנים עשר נוירונים בו זמנית, כמעט ואכפיל את המספר הגדול ביותר של תאי עצב בו זמנית ובכך מרחיק הידק התיקון. דוגמאות לרשתות של קשרים סינפטיים ישירים בין פירמידת נוירונים נרשמו בשכבת V של הקליפה החושית של חולדות מוצגות באיור 6. קביעת פרופילי הסתברות חיבור כפונקציה של מרחק בין גופני לתאים מסוג מסוים היא מדידה אופיינית של עניין שניתן לבצע ביעילו...

הקלטות תיקון מהדק Multi-אלקטרודה מהוות משימה מורכבת. כאן אנו מראים כיצד, על ידי אוטומציה של רבים מהשלבים הניסיוניים, זה אפשרי כדי להאיץ את התהליך מוביל לשיפור איכותי בביצועים ומספר ההקלטות.

מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע הקלטות מהדק תיקון של עד 12 תאים במצב תא שלם. זה מושג על ידי סימון המיקום של כל תא מעניין והקצאת פיפטה לכל תא. השלב השני הוא לאתר את הקצה של כל פיפטה ולהזיז אוטומטית את הפיפטות ליד התאים שהוקצו להן.לאחר מכן, התקרב לכל תא עם פיפטה אחת בכל פעם. כדי ליצור אטמים הדוקים עם קרום התא, השלב האחרון הוא לקרוע את קרום התאים ולבצע הקלטות של תאים שלמים. בסופו של דבר, הקלטת מהדק תיקון מרובה אלקטרודות בעזרת מחשב משמשת להצגת מאפייני הרשת של מעגלים עצביים קטנים ברזולוציה גבוהה.היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מהדק תיקון ידני הוא שמספר הקשרים שניתן לראות ברשת גדל עם ריבוע מספר הנוירונים שנרשמים. הדגמה חזותית של טכניקה זו חשובה מכיוון ששלבי מהדק התיקון יכולים להיות קשים ללימוד בגלל המורכבות והמהירות שבה יש לבצע אותם. התחילו בהליך זה על ידי הצבת פרוסת מוח עם אזור העניין במרכז טווח התזוזה של המיקרוסקופ.לאחר מכן, זהה את התאים המעניינים. לאחר מכן שמור את מיקום התאים על סמך מערכת הקואורדינטות של המיקרוסקופ. הממשק הגרפי יציג את התאים שנבחרו כמו גם את המיקרו פיפטות לסקירה גלובלית, והתוכנה תוסיף סמן על מיקום התא שיוצב על התמונות.בנוסף, תמונה של התא מצולמת לעיון עתידי. לאחר בחירת התאים המעניינים, הקצה את הפיפטות שישמשו להקלטת התאים הבודדים על ידי הגדרת פקדי הה

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

זה נועד כהקדמה תיקון הקלטה מהדק מ ביציות Xenopus laevis. היא משתרעת על הסרת vitelline קרום, היווצרות חותם gigaohm (gigaseal), ואת ההמרה אופציונלי של תיקון כדי טופולוגיה מחוץ הקצוב.

הצמד תיקון הקלטה של ​​תעלות יונים מתבטא ביציות Xenopus

יונית הנוכחי של BK ערוצי נרשם באמצעות מהדק טכניקות תיקון. ערוצי BK באים לידי...

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

פרוטוקול זה מתאר טכניקה הנקראת אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי שלם, שהיא שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירוני מאוטנר ותאים רטיקולוספינליים אחרים בעוברים של דגי זברה.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי תאי שלם: שיטה לחקר תכונות חשמליות של נוירונים

סרטון זה מדגים אפיון של זרמים קטיוניים מתעלות יונים מסוג 4 (TRPM4) של קולטן חולף בתאי שריר חלק באמצעות אמפוטריצין-B בטכניקת מהדק טלאי מחורר בתיווך. הטכניקה מסייעת להעריך את התכונות הביופיזיקליות והפרמקולוגיות של תעלות יונים.

Amphotericin-B מתווך תיקון מהדק תיקון: טכניקה אלקטרופיזיולוגית לחקר זרמים יוניים בתאי שלפוחית השתן

בסרטון זה, פרוסות מוח משותקות בתא הקלטה, ותאים מעניינים מאותרים וממוקדים באמצעות מיקרוסקופ נשלט מחשב. לאחר מכן, מערכת עיבוד התמונה האוטומטית ממקמת במדויק פיפטה טלאי כדי לאטום את קרום התא ולנטר אותות חשמליים.

טכניקת מהדק טלאי מונחה תמונה אוטומטית לחקר תאי עצב בפרוסות מוח

פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע ​​על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

אפיון אלקטרופיזיולוגי של cardiomyocytes הנגזר האדם בתאי גזע Pluripotent (hPSC-CMs) הוא קריטי עבור מודלים של מחלות לב ולקביעת תגובות סמים. פרוטוקול זה מספק את המידע הדרוש כדי לנתק צלחת hPSC-CMs על מערכים אלקטרודה רב, למדוד את פוטנציאל השדה שלהם, וכן שיטה לניתוח QT ו RR מרווחי.

ניתוח אלקטרופיזי של האדם Pluripotent גזע גזע נגזר Cardiomyocytes (hPSC-CMs) באמצעות מערכים אלקטרודה רב (MEAs)

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע אוטומטית תמונה מודרך תיקון ניסויים מהדק באמצעות מערכת שפותחה לאחרונה עבור תקן במבחנה electrophysiology ציוד.

יישום אוטומטי של תמונה מודרך תיקון מהדק לחקר נוירונים של פרוסות המוח

כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

למדו כיצד לבצע הקלטות patch-clamp מרובות-אלקטרודים בסיוע מחשב עד ל-12 תאים במצב whole cell. שיטה זו מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של תכונות רשתות עצביות קטנות במוח.

מערכת תיקון מהדק Multi-אלקטרודה בסיוע מחשב

גלה סרטונים נוספים