Name: ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: חקור תגובת מערכת החיסון לשתלים ביורפואיים באמצעות ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח תאי חיסון ברקמות שתל מנותחות ומסייע בפיתוח שתלים רפואיים משופרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלי של ה-NIH, כולל המכון הלאומי לדימות ביו-רפואי וביו-הנדסה. כתב ויתור: ה-NIH, נושאי המשרה שלו ועובדיו אינם ממליצים או תומכים בשום חברה, מוצר או שירות.

הערה: איור 1 נותן סקירה כללית של פרוטוקול ציטומטריית הזרימה.
1) הכנת ריאגנטים
<ol><li>הכינו מדיה לדילול אנזימים ולתרבית רקמות.<ol><li>הוסף 5 מ"ל של תמיסת חיץ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ל-500 מ"ל של סל"ד בינוני ונער היטב. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.</li>
	</ol></li>
	<li>חשב את נפח תמיסת האנזים. הערה: נפח תמיסת האנזים הוא נפח התווך המכיל את האנזימים (collagenase ו- DNase I) הדרושים לעיכול רקמות חתוכות לקוביות בצלחות 6 בארות; זה תלוי במספר הדגימות.<ol><li>השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את אמצעי האחסון הנדרש: (מספר הדגימות לעיכול) × 5 מ"ל של סל"ד ללא סרום עם חיץ HEPES של 10 mM הערה: לדוגמה, עבור 0.1 עד 0.3 גרם של טחול מנותח, השתמש 5 מ"ל של מדיום כדי להכין את תמיסת האנזים. פרוטוקול העיכול האנזימטי המתואר בכתב יד זה מיועד בעיקר לרקמות רכות (בטווח שבין 0.1 ל-1 גרם) המנותחות מעכברים הכוללות את המוח, הכליות, העור, הכבד, הריאות, הטחול, השרירים וכן קפסולות סביב שתלים תת-עוריים העשויים מחומרים סינתטיים או חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. עיכול רקמות סחוס קשות עשוי לדרוש תנאים שונים ונפחים שונים של אנזימי עיכול, אשר ניתן לברר רק על ידי אופטימיזציה.</li>
		<li>חשב את כמות collagenase ו- DNase שהייתי צריך עבור תמיסת אנזים. הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש ב-0.25 מ"ג/מ"ל של קולגנאז ו-0.2 מ"ג/מ"ל של DNase I. ריכוזי העבודה הנדרשים עבור collagenase ו- DNase יכולים להשתנות עבור סוגים שונים של רקמות19.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו תמיסת צבע בכדאיות בקנ"מ 1:1000 על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של צבע הכדאיות (ראו טבלת חומרים) ל-999 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS) ומערבלו את התמיסה. יש לאחסן את התמיסה בחושך בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.</li>
	<li>הכינו את מאגר הצביעה על ידי הוספת גרם אחד של אלבומין בסרום בקר (BSA) ל-100 מ"ל PBS, וערבבו את התמיסה עד להמסת BSA לחלוטין. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.</li>
</ol>2) הגדרת לוחות עיכול אנזימטיים
<ol><li>הגדר צלחת 6 בארות עם מסננות תאים 70 מיקרומטר בכל באר. מוסיפים 3 מ"ל של המדיום המוכן משלב 1.1.1 לכל באר, ודגרים על קרח.</li>
	<li>יש לאחסן את המדיה הנותרת (2 מ"ל/באר) באינקובטור או באמבט מים בטמפרטורה של 37°C להשעיית הכמות המחושבת של collagenase ו-DNase I (שלב 1.2.2).</li>
</ol>3) בידוד תאים
<ol><li>מניחים את השתלים/הרקמה המנותחים בצלחות, וחותכים דק בעזרת מספריים. לחלופין, השתמש בשיטת הפרעה מכנית באמצעות דיסוצייאטור רקמות או הומוגנייזר ידני. בשל המספר הגבוה של לויקוציטים, יש לנתח את הטחול כדי להשתמש בו כבקרת כתמים בכל ריצה. הערה: מכיוון שחומרים מסוימים גורמים לרמות גבוהות יותר של פיברוזיס, פרוטוקול זה ישים הן עבור חומרים פיברוטיים מאוד והן עבור חומרים פיברוטיים מינימליים. עם זאת, יש להעריך כל שיטת עיבוד הן מבחינת תפוקת התאים והן מבחינת הכדאיות לאחר העיכול לפני הצביעה. הימנע זיהום דם היקפי במהלך דיסקציה.</li>
	<li>הוסף collagenase ו- DNase I (נפח מחושב בשלב 1.2.2) ל- RPMI הנותר (2 מ"ל) שחומם ל- 37 ° C. הוסף 2 מ"ל של תמיסת האנזים המלאה לכל באר.</li>
	<li>הניחו את הצלחות בשייקר מודגר למשך 45 דקות ב-37°C וב-100 סל"ד. הערה: היזהר בעת ערימת צלחות מכיוון שהדבר עלול לעכב העברת חום נכונה.</li>
	<li>בינתיים, הכינו קצה לחלוקת מתלים על ידי קיצוץ 3-4 מ"מ מקצה קצה 1000 μL עם מספריים. לאחר הדגירה, פיפטה את התרחיף בבארות למעלה ולמטה כדי לערבב אותו היטב באמצעות קצה קצוץ. מניחים את מסננת התא על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל ומעבירים את התמיסה המעוכלת דרך מסננת התא. הערה: מסננת התאים בגודל 70 מיקרומטר מספיקה כדי להפריד תאים מביו-חומר מושתל, כגון אלגינט. אם נדרש טוהר רב יותר, השתמש בתהליכים כגון הפרדת שיפוע צפיפות כדי להשיג אוכלוסייה מועשרת של לויקוציטים.</li>
	<li>שטפו את הבארות בתמיסת PBS 1x, והעבירו את נפח השטיפה דרך המסננת, ולאחר מכן הוסיפו את שטיפות המסננת בתמיסת PBS 1x עד שהנפח בצינור מגיע ל-50 מ"ל. הערה: PBS 1x חייב להיות בטמפרטורת החדר כדי למנוע כל עלייה בצמיגות העיכול ולאפשר כדורי תאים במהלך צנטריפוגה.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוף את הסופרנאטנט בזהירות באמצעות פיפטה סרולוגית מבלי להפריע לכדורית. להשעות מחדש את הגלולה ב 1000 μL של 1x PBS, ולהעביר את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה.</li>
	<li>מערבבים 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של כחול טריפאן, וטוענים את המתלה על שקופיות תא ספירה לספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או על המוציטומטר לספירה בשיטה המקובלת תחת מיקרוסקופ. לחלופין, השתמש בחרוזים לספירת תאי ציטומטריה של זרימה.</li>
</ol>4) צביעה לציטומטריית זרימה
<ol><li>ראו איור 2 לדוגמה פריסת לוחות עבור ניסוי של 14 צבעים עם 45 דגימות, פקדי פלואורסצנטיות פחות אחד (FMO), בקרות פיצוי ובקרת דגימת טחול מוכתמת במלואה. לאחר הערכת המספר הכולל של תאים, חשב את נפח תרחיף התא הדרוש לצביעת 1 × 106 תאים עבור כל דגימה, ו- 0.5 × 106 תאים עבור כל פיצוי ובקרת FMO. הוציאו את הנפח הנדרש של תרחיף התא לבארות של צלחת V תחתונה 96 בארות, והשלימו את הנפח ל -100 μL עם PBS 1x. הערה: לדוגמה, אם 1000 μL של תרחיף תאים המתקבל בשלב 3.6 מכילים 40 × 10 6 תאים, אז עבור 1 × 10 6 תאים, 1000/40 × 106 = 25 μL של השעיית תאים יידרש. </li>
	<li>צנטריפוגו את הצלחת ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, לשאוף את supernatant, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים בבארות הדגימה ובבאר בקרת פיצוי כדי לקבוע כדאיות, עם 100 μL של תמיסה 1:1000 של צבע הכדאיות (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>עבור תאים בבארות פיצוי אחרות, כמו גם FMO ובארות לא מוכתמות, להשעות אותם עם 100 μL של 1x PBS.</li>
	<li>לדגור על התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>בינתיים, הכינו קוקטייל נוגדנים משטח להכתמת הדגימה ובקרות FMO: 50 מיקרוליטר לדגימה או FMO. ראו טבלה 1 לדוגמה של קוקטייל הנוגדנים.</li>
	<li>לאחר הדגירה, להוסיף 100 μl של 1x PBS לכל באר, להסתובב למטה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>לשאוף את supernatant ו resuspend ב 200 μL של חיץ צביעה (1x PBS + 1% BSA); צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>לשאוף את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים פיצוי, FMO, בארות לא מוכתמים עם 50 μL של 1x PBS. הוסף 50 μL של קוקטייל הנוגדנים לבארות הדגימה ולבארות FMO המתאימות. הוסף את הנוגדנים המתאימים לבארות הפיצוי השונות.</li>
	<li>לדגור על הצלחת במשך 45 דקות בחושך ב 4 ° C. לאחר הדגירה, להוסיף 150 μL של חיץ מכתים בכל באר, ולצנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים עם 200 מיקרוליטר של חיץ צביעה, וצנטריפוגו את תרחיף התא ב 300 × גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>אם מנתחים דגימות ללא קיבוע, יש להשעות אותן מחדש ב-200 מיקרוליטר של חיץ צביעה, ולהמשיך לסעיף 6 על הגדרת ציטומטר וניתוח דגימות. אם מקבעים את התאים, יש לשאוף את הסופרנאטנט לאחר השטיפה, ולהוסיף 100 μL של חומר קיבוע כגון 4% פרפורמלדהיד. אם יש צביעה לסמנים תוך-תאיים, יש לעבור לסעיף 5 בנושא צביעה תוך-תאית, ולתקן ולחדור לתאים (ראו טבלת חומרים). לדגור על תאים במשך 20 דקות בחושך ב 4 ° C. הערה: מכיוון שקיבוע יכול להשפיע על עוצמת הפלואורסצנטיות של פלואורופורים מסוימים, הערך כל פאנל עם ובלי קיבוע.</li>
	<li>לאחר הדגירה, להוסיף 100 μL של 1x PBS, ואחריו צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש ב-1x PBS וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C.</li>
	<li>יש להשהות מחדש את התאים ב-200 μL של חיץ הצביעה, ולאחסן ב-4°C לפני ניתוח ציטומטרי של זרימה.</li>
</ol>5) צביעה תוך תאית
<ol><li>המשך משלב 4.11 עבור קיבוע וחדירה עבור סמנים תאיים, להוסיף 100 μL של המאגר המתאים. צנטריפוגה את התאים ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את supernatant, ולתלות מחדש את הכדורים ב 200 μL של תמיסת סוכן מחלחל; צנטריפוגה את התאים ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הכדוריות עם נוגדנים תוך תאיים מדוללים בחיץ המתאים. הערה: סוגי נוגדנים ודילול יהיו תלויים בתאי היעד. לדוגמה, סמן תוך-תאי נפוץ אחד הוא תיבת ראש מזלג P3 עבור תאי T רגולטוריים, אשר משמש לעתים קרובות בדילול של 1:100.</li>
	<li>לדגור על תרחיף התא בחושך במשך 45 דקות ב 4 ° C. לאחר הדגירה, להוסיף 150 μL של המאגר המתאים, וצנטריפוגה את המתלה ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>שאפו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את התאים ב 200 מיקרוליטר של חיץ צביעה ואחריו צנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו והשעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של חיץ מכתים לצורך ניתוח ציטומטרי של זרימה.</li>
</ol>6) ציטומטר והגדרת פיצוי
<ol><li>מיד לפני הרצת הדגימות, הכינו חרוזי פיצוי (ראו טבלת חומרים) אם משתמשים בפיצוי מבוסס חרוזים לעומת פיצוי מבוסס תאים.<ol><li>תייגו צינורות מיקרו-צנטריפוגות נפרדים עבור כל נוגדן מצומד פלואורוכרום, והוסיפו 100 μL של 1x PBS ואחריו טיפה אחת מלאה של חרוזי פיצוי בקרה שלילית נגד עכברים וטיפה אחת של חרוזי פיצוי בקרה חיובית לכל צינור. הוסף 1 μL של הנוגדן המתאים לכל צינור נפרד. מערבלים ודגרים במשך 5 דקות לפני הרכישה. הערה: מכיוון שלא ניתן לקשור צבעים מסוימים, כגון BUV737, לחרוזים, השתמש בפקד מבוסס תאים.</li>
	</ol></li>
	<li>כייל את ציטומטר הזרימה לפני כל ניסוי על ידי הפעלת מערך הציטומטר עם חרוזי המעקב, ושמור על הגדרות ציטומטר הזרימה עבור כל ניסוי.</li>
	<li>לפני ניתוח הדגימה, התאימו את ציטומטר הזרימה על ידי הפעלת דגימה לא מוכתמת כדי להתאים את אוכלוסיית התא בתרשים פיזור צדדי (SSC) לעומת פיזור קדימה (FSC) כך שאוכלוסיית התא תיפול במרכז העלילה ולא תהיה מחוץ לקנה המידה.</li>
	<li>הפעל את הדגימה המוכתמת לזמן קצר כדי להתאים את המתחים עבור FSC ו- SSC ועבור כל ערוץ כדי לוודא שאף אירוע אינו חורג מהסולם הלוגריתמי של כל ערוץ. שיא של 5,000 אירועים עבור כל בקרת פיצוי, ואחריה גידור של אוכלוסיות חיוביות ושליליות. חשב את מטריצת הפיצוי ולאחר מכן הפעל את הדגימות, איסוף לפחות 1,000 אירועים עבור האוכלוסיות המעניינות. הערה: יש לוודא פיצוי על לוחות צבעוניים גדולים יותר, מכיוון שפיצוי אוטומטי עלול להיות מועד לפיצוי יתר או חסר. כל פרמטר צריך להיות גרף מול כל פרמטר אחר כדי לעקוב אחר סימנים של פיצוי יתר או חסר, וכל פקד בצבע יחיד צריך להיות מוערך. פיצוי מורכב של ניסויים בצבע גדול יותר צריך להתבצע בסיוע של משתף פעולה או מתקן ליבה עם ניסיון ציטומטריה זרימה נרחב. סוגים חדשים יותר של ציטומטרים של זרימה כגון ציטומטרים ספקטרליים מנצלים את הספקטרום המלא של פלואורופור בתהליך המכונה אי-ערבוב ספקטרלי, אשר יכול להניב הבחנה נקייה יותר של חפיפה פלואורסצנטית בהשוואה לפיצוי סטנדרטי בלבד22.</li>
</ol>

<ol><li>Joung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+implantable+medical+devices%3A+from+an+engineering+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22International+Neurourology+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of implantable medical devices: from an engineering perspective.</a> International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).</li>
<li>Langer, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+for+the+sustained+release+of+proteins+and+other+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.</a> Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).</li>
<li>Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRolfe%2C+B+%22Regenerative+Medicine+and+Tissue+Engineering-Cells+and+Biomaterials%22">Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials</a>. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).</li>
<li>Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+and+dynamic+analyses+of+fracture+fixation+bone-plate+systems+for+different+plate+materials+and+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Medical+Materials+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions.</a> Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).</li>
<li>Kang, C. -W., Fang, F. -Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+of+bioimplants+manufacturing%3A+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Manufacturing%22%5BJournal%5D)">State of the art of bioimplants manufacturing: part I.</a> Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).</li>
<li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+immune+responses+to+synthetic+and+biological+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds.</a> Biomaterials. 192, 405-415 (2019).</li>
<li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design%2C+clinical+translation+and+immunological+response+of+biomaterials+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine.</a> Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040(2016).</li>
<li>Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+engineering+for+immunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Materials engineering for immunomodulation.</a> Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).</li>
<li>Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+phenotype+as+a+determinant+of+biologic+scaffold+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).</li>
<li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polypropylene+surgical+mesh+coated+with+extracellular+matrix+mitigates+the+host+foreign+body+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Material+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response.</a> Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zwitterionic+hydrogels+implanted+in+mice+resist+the+foreign-body+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).</li>
<li>Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+implants+modulate+healing+and+induce+shifts+in+local+macrophage+polarization+in+the+foreign+body+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction.</a> Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).</li>
<li>Tan, H., Marra, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable%2C+Biodegradable+hydrogels+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications.</a> Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).</li>
<li>Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+polymerizations%3A+untapped+potential+for+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Advance+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials.</a> Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861(2019).</li>
<li>Sadtler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+pro-regenerative+biomaterial+scaffold+microenvironment+requires+T+helper+2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells.</a> Science. 352 (6283), 366-370 (2016).</li>
<li>Gower, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+leukocyte+infiltration+and+phenotype+in+microporous+tissue+engineering+scaffolds+via+vector+induced+IL-10+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression.</a> Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).</li>
<li>Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+and+bioactive+factor+delivery+systems+for+the+control+of+macrophage+activation+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).</li>
<li>Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+antigen-specific+immunological+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+Immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering antigen-specific immunological tolerance.</a> Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).</li>
<li>Sadtler, K., Elisseeff, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+scaffold+immune+microenvironment+using+flow+cytometry%3A+practices%2C+methods+and+considerations+for+immune+analysis+of+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials.</a> Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).</li>
<li>Baumgarth, N., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+multicolor+flow+cytometry+for+immunophenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping.</a> Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+Flow+Cytometry%22">Practical Flow Cytometry</a>. , Wiley. (2003).</li>
<li>Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNolan%2C+JP+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).</li>
<li>Wolf, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biologic+scaffold-associated+type+2+immune+microenvironment+inhibits+tumor+formation+and+synergizes+with+checkpoint+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy.</a> Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).</li>
<li>Kahng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+white+blood+cell+differential+using+CytoDiff+is+excellent+for+counting+blasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+laboratory+medicine%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts.</a> Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).</li>
<li>Sionov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+neutrophils+with+anti-tumor+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52933(2015).</li>
<li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+sputum%3A+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Inhalation+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li>
<li>Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+leukocyte+populations+in+fresh+and+cryopreserved+sputum+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

סקירה זו מתארת מתודולוגיה מפורטת לבידוד תאים משתלים ביו-חומריים להשגת תרחיף תאים אחיד. בנוסף, סופק פרוטוקול מפורט לצביעת תרחיף התא עבור ציטומטריית זרימה צבעונית, יחד עם השלבים להגדרת ציטומטר זרימה לקבלת תוצאות אופטימליות. שיטות בידוד תאים יכולות לכלול שלבים מרובים, לעתים קרובות באמצעות דיסקציה ידנית של רקמות ואחריה עיכול אנזימטי עם אנזימים מפרקי חלבון כדי לנתק את המטריצה החוץ תאית ברקמה ולשבש את הצטלבויות התא כדי לשחרר תאים בודדים מהרקמה. לאחר העיכול, יש צורך בעיבוד נוסף, כגון מאמץ תאים, כדי להסיר את הפסולת שנותרה ולהבטי...

ההתקדמות בתחום הרפואה הובילה לשימוש תכוף בחומרים מושתלים לתמיכה בתפקוד או צמיחה מחדש של רקמות פגועות 1,2. אלה כוללים מכשירים כגון קוצבי לב, שתלים קוסמטיים משחזרים, ולוחות אורתופדיים המשמשים לקיבוע שבר עצם 3,4. עם זאת, החומרים המשמשים לייצור שתלים אלה והמיקומים שבהם הם מושתלים ממלאים תפקיד חשוב בקביעת ההצלחה של שתלים אלה 5,6,7. כגופים זרים, שתלים אלה יכולים ליצור תגובה חיסונית מהמארח שיכולה להוביל לדחייה או לסבילות8. גורם זה הניע את המחקר הביו-חומרי ליצור חומרים שיכולים למשוך את התגובה החיסונית הרצויה לאחר ההשתלה 9,10,11,12.
התגובה החיסונית היא דרישה חיונית בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כאשר רקמה או איבר גדלים סביב שלד ביו-חומרי (פיגום) במעבדה להחלפת רקמה או איבר פגומים13,14,15,16. ברפואה רגנרטיבית, המטרה היא להחליף רקמות חסרות או פגומות באמצעות שימוש בתאים, אותות ופיגומים, שכל אחד מהם יכול להיות מווסת במידה רבה על ידי תגובות חיסוניות17. יתר על כן, גם כאשר רוצים חוסר תגובה חיסונית, לעיתים רחוקות מאוד מדובר בהיעדר פעילות חיסונית ולא בנוכחות פרופיל ויסות רצוי18 . טכניקות כגון ציטומטריית זרימה יכולות למלא תפקיד משמעותי באפיון דפוס התגובה החיסונית לביו-חומרים שונים המשמשים לציפוי מכשירי שתלים או לפיתוח פיגומים להנדסת רקמות19.
מידע זה, בתורו, יסייע בסופו של דבר בפיתוח ביו-חומרים לשתלים שיכולים להיות נסבלים היטב על ידי מערכת החיסון או בפיתוח פיגומים שיכולים למלא תפקיד בונה בהנדסת רקמות. הכנה נכונה של דגימות לניתוח לפי ציטומטריית זרימה היא צעד חשוב למניעת תוצאות לא מדויקות באפיון חיסוני באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי20,21. לכן, סקירה זו מציגה מתודולוגיה מפורטת שניתן להשתמש בה לבידוד תאים מרקמת פיגום, צביעת תרחיף התא וניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

<table><tbody><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>6 באר צלחת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-000-646</td><td></td></tr><tr><td>BD מאגר כתמים מבריק פלוס</td><td>BD Biosciences</td><td>566385</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td>לקיבוע תאים בלבד</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906</td><td>להכנת FACS מאגר מכתים</td></tr><tr><td>CD11b AF700</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>שיבוט: M1/70</td></tr><tr><td>CD11c PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>117325</td><td>שיבוט: N418</td></tr><tr><td>CD197 PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>120121</td><td>שיבוט: 4B12</td></tr><tr><td>CD200R3 APC</td><td>Biolegend</td><td>142207</td><td>שיבוט: Ba13</td></tr><tr><td>CD206</td><td>PE Biolegend</td><td>141705</td><td>שיבוט: C068C2</td></tr><tr><td>CD45 BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612778</td><td>שיבוט: 104/A20</td></tr><tr><td>CD86 BUV395</td><td>BD Biosciences</td><td>564199</td><td>שיבוט: GL1</td></tr><tr><td>CD8a BV421</td><td>Biolegend</td><td>100737</td><td>שיבוט: 53-6.7</td></tr><tr><td>Comp Bead anti-mouse</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>552843 לבקרת פיצוי</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td>בקר לבלב דאוקסיריבונוקלאז I (DNase I)</td></tr><tr><td>F4/80 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123113</td><td>שיבוט: BM8</td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>Biolegend</td><td>101301</td><td>שיבוט: 93</td></tr><tr><td>קיבוע/חדירות פתרון ערכת BD</td><td>Biosciences</td><td>554714</td><td>לקיבוע וחדירות של תאים.</td></tr><tr><td>מאגר HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>Buffer להשלמת מדיה תאית</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>5401127001 תערובת של קולגנאז מטוהר I וקולגנאז II</td></tr><tr><td>חי/מת ערכת כתמי תאים מתים כחולים לתיקון Thermo</td><td>Fisher</td><td>L23105</td><td>צבע כדאיות</td></tr><tr><td>Ly6c AF488</td><td>Biolegend</td><td>128015</td><td>שיבוט: HK1.4</td></tr><tr><td>Ly6g BV510</td><td>Biolegend</td><td>שיבוט 127633</td><td>: 1A8</td></tr><tr><td>MHCII BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>742894</td><td>שיבוט: M5 / 114.15.2</td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח</td><td>תרמו פישר</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>תרמו פישר</td><td></td><td>11875176 מדיה לתרבית תאים</td></tr><tr><td>Siglec F BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>740388</td><td>שיבוט: E50-2440</td></tr><tr><td>צלחת</td><td></td><td></td> <td>V-bottom 96 בארות</td></tr></tbody></table>

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

ההצלחה של השתלת רקמה שגודלה במעבדה או מכשיר רפואי באדם כפופה לתגובה החיסונית של המארח המקבל. בהתחשב בשתל כגוף זר, תגובה חיסונית עוינת ולא מווסתת עלולה לגרום לדחיית השתל, בעוד תגובה מווסתת והחזרת הומאוסטזיס יכולה להוביל לקבלתו. ניתוח המיקרו-סביבות של שתלים המנותחים תחת הגדרות in vivo או ex vivo יכול לסייע בהבנת דפוס התגובה החיסונית, אשר בסופו של דבר יכול לסייע בפיתוח דורות חדשים של ביו-חומרים. ציטומטריית זרימה היא טכניקה ידועה לאפיון תאי מערכת החיסון ותת-קבוצותיהם בהתבסס על סמני פני התא שלהם. סקירה זו מתארת פרוטוקול המבוסס על חיתוך ידני, עיכול אנזימטי וסינון באמצעות מסננת תאים לבידוד מתרחיפים אחידים של תאים מרקמת השתל המנותחת. יתר על כן, הוסבר פרוטוקול צביעת ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים, יחד עם שלבים להגדרות ציטומטר ראשוניות כדי לאפיין ולכמת תאים מבודדים אלה על ידי ציטומטריית זרימה.

תהליך הפיתוח של לוחות ציטומטריית זרימה לניתוח חיסוני מסתמך לעתים קרובות על השוואת התוצאות לנתונים הקיימים ולספרות בתחום. הידע על האופן שבו אוכלוסיות עשויות להופיע בציטומטריית זרימה הוא קריטי לפרשנות נכונה של נתונים. בכל מקרה, אוכלוסיות וסוגי תאים יכולים להופיע באופן שונה ברקמות שונות, כך שיש לצפות לשונות מסוימת. בהקשר של רקמות בקרה מוגדרות היטב, אופטימיזציה כזו של צביעה יכולה להיות מוערכת מול רקמות ידועות שיש להן סוגי תאים שנחקרו היטב. איור 3 מציג את התוצאות ...

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

פרוטוקול זה יכול לעזור לנו לאפיין את התגובה החיסונית של המאכסן כנגד ביו-חומרים שונים, אשר לאחר מכן יכולים לסייע בתכנון שתלים רפואיים עתידיים טובים יותר. ציטומטריית זרימה מספקת לנו מידע על תאי מערכת החיסון החודרים לחומר ביולוגי, מה שעוזר לנו לקבוע מנגנונים של האופן שבו תאים מגיבים לפציעה ולהשתלת חומרים, כמו גם מטרות לשיפור הטיפולים. ניתן לשנות את אותו פרוטוקול כדי לאפיין תגובה חיסונית בסביבות שונות.נתחו את השריר המרובע של עכברים שקיבלו שתל ECM לפני שבוע ונאספו בצינור של 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מדיה נטולת סרום. לבסוף חתכו את הרקמה בעזרת מספריים. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מדיה אנזימי העיכול לצינור.הניחו את הצינורית המכילה חומר עיכול ורקמות חתוכות לקוביות באינקובטור רעד למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-100 סל"ד. בסוף מסנן הדגירה מסננים את תרחיף הרקמה המעוכלת דרך מסננת 70 מיקרון לתוך צינור 50 מיליליטר בודד. השתמש בראש מזרק חמישה מיליליטר כדי לרסק כל גוש מוצק של רקמות ולשטוף את המסננת עם PBS בטמפרטורת החדר.יש להשליך את השאריות שנותרו במסננת ולהתאים את נפח הצינור ל-50 מיליליטר עם PBS בטמפרטורת החדר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולהשהות מחדש את הכדוריות ב 10 מיליליטר של תמיסת EDTA חמישה מילימולרית קרה ב- PBS. אם תאי הדם נמצאים בדגימה, להשעות מחדש את הגלולה

high-dimensionality-flow-cytometry-for-immune-function-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

סרטון זה מדגים פרוטוקול להערכת ההפעלה של תאים דנדריטיים באמצעות תאי גידול מצופים אימונוגלובולין G (IgG). תאים דנדריטיים מפנימים את תאי הגידול המצופים IgG, מעבדים את האנטיגנים של הגידול ומציגים אותם על פני השטח באמצעות מולקולות MHC-II, יחד עם ביטוי משותף של מולקולת קוסטימולטורית CD86. תאים דנדריטיים אלה עוברים ניתוח של אימונוסטיין ממוקד MHC-II ו-CD86 וניתוח ציטומטריית זרימה כדי לזהות את מצב ההפעלה שלהם.

ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה של הפעלת תאים דנדריטיים באמצעות קומפלקסים חיסוניים

דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהוא פועל כחרב פיפיות המחמירה פגיעה מוחית מוקדמת, אך גם תורמת לתיקון מאוחר יותר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי חיסון מהמוח האיסכמי ואת הפנוטיפ הציטומטרי הזרימה שלהם לאחר מכן.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מלאה לניתוח כמותיים של המערכת החיסונית הסינפסות בין ראשי תאי T אנושיים תאים אנטיגן. השיטה מבוססת על מיכשור הדמיה, אשר מאפשר רכישת הערכה של מספר תאים אלף תמונות בתוך תקופה קצרה יחסית של זמן.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול להכנת תאים בודדים של בלוטת התימוס מאתר הלבלב ניקוז הלימפה והטחול ללימוד נוסף תאים אלה באמצעות cytometry זרימה. בנוסף, פרוטוקול זה שימש לקביעת תת-קבוצות של הרגולציה ותאי T באמצעות cytometry זרימה.

קביעת קבוצות משנה תא T רגולטורי ב מאתר התימוס, הלבלב ניקוז הלימפה והטחול באמצעות Cytometry זרימה

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול cytometric זרימה כדי לזהות CD4+ ו CD8+ T תאים, התאים γδ T, תאים B, תאי NK ומונוציטים בדם היקפי האנושי באמצעות fluorochromes רק שני במקום שבעה. עם גישה זו, ניתן לרשום חמישה סמנים נוספים על רוב זרימה cytometers.

אפליה של שבע קבוצות משנה תא החיסון על ידי שני-fluorochrome לזרום Cytometry

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.

ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

המתוארת כאן היא שיטה שניתן להשתמש בה כדי לצלם חמישה פרמטרים פלואורסצנטיים או יותר על ידי מיקרוסקופ immunofluorescent. מתואר צינור ניתוח לחילוץ תאים בודדים מתמונות אלה ולביצוע אנליזה של תא בודד באמצעות אסטרטגיות gating דמויות ציטומטריה של זרימה, אשר יכולות לזהות תת-קבוצות תאים במקטעי רקמות.

הפקה וניתוח של תמונות היסטולוגיה בעלות פרמטרים גבוהים באמצעות ציטומטריה של Histoflow

פרוטוקול זה מתאר שיטת ניתוח מקיפה של ציטומטריית מסה (ציטומטריה לפי זמן טיסה [CyTOF]) להערכת תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בקרצינומה של הכבד (HCC). הגישה שואפת לספק תובנות לגבי הנוף החיסוני של HCC, ולהציע הבנה מעמיקה יותר של המיקרו-סביבה של הגידול והמנגנונים החיסוניים הנלווים.

ניתוח ציטומטריית מסה של תגובות חיסוניות מערכתיות ומקומיות בקרצינומה של הכבד

במאמר זה, אנו מתארים את שיטת ניצול רב רפאים זרימת cytometry הדמיה לכמת את ההפנמה של חלקיקים polyanhydride או חיידקים של 264.7 תאים הגלם.

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

חקור תגובת מערכת החיסון לשתלים ביורפואיים באמצעות ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח תאי חיסון ברקמות שתל מנותחות ומסייע בפיתוח שתלים רפואיים משופרים.

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

גלה סרטונים נוספים