Name: אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: למד שיטת ניתוח תמונה מבוססת אזור לכימות תרביות משותפות של תאים. השיטה מבדילה בין Raw 264.7 מקרופאגים לתאי NIH/3T3 פיברובלסטים ומספקת תובנות לחידוש רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 AR067247) ובחלקה על ידי תוכנית INBRE של דלאוור, הנתמכת על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים - NIGMS (P20 GM103446) מהמכונים הלאומיים לבריאות ומדינת דלאוור. תוכן כתב היד אינו משקף בהכרח את דעותיהם של הגורמים המממנים.

1. תרבית תאים ורכישת תמונות
<ol><li>תרבית RAW264.7 מקרופאגים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1.5 גרם/ל ליטר נתרן ביקרבונט ו-5 מיקרומטר β-מרקפטואתנול.<ol>
<li>להדמיית מונוקולטורה, תרבית תאי RAW264.7 בצפיפות של 25,000 תאים/ס"מ2 בבקבוקון תרבית תאים של 5 מ"ל עם 1 מ"ל של מדיום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תאי NIH/3T3 בתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין11.</li>
	<li>עבור הדמיית קוקולטורה, מקרופאגים RAW264.7 מתרבית ופיברובלסטים NIH/3T3 מתאחדים יחד ביחסים מגוונים, בצפיפות כוללת של 25,000 תאים/ס"מ2. השתמשו במדיום קוקולטורה שהוא 1 חלק RAW264.7 בינוני (DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1.5 גרם/ל' נתרן ביקרבונט, ו-5 μM β-מרקפטואתנול) ו-1 חלק NIH/3T3 בינוני (DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).</li>
	<li>לאחר הזריעה, הדגירה של תאים בטמפרטורה של 37 °C (87 °C) ו-5% CO2 כדי להגיע לצפיפות תאים בת קיימא של 80% מפגש תאים.</li>
	<li>תאי תמונה עם מיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה של פי 40. רכוש את כל התמונות בגווני אפור וייצא אותן בקובץ '.czi' הגולמי.<ol>
<li>קבע את יכולת האלגוריתם להעריך במדויק תמונות עם מגוון איכויות תמונה. רכשו תמונות עם מוקדים משתנים, והפיקו גם תמונות 'לא בולבוסיות' (איור 2) וגם תמונות 'בולבוסיות' (איור 3).</li>
		<li>ייצא והמר תמונות תאים לתבנית התמונה tiff (.tiff) של 8 סיביות באמצעות ImageJ באמצעות הפונקציה 'המרת אצווה' בקבצי '.czi' הגולמיים לפני ניתוח MATLAB. אחסן תמונות שהומרו בתיקיה מקומית והעבר באופן ידני קבצי תמונה אלה לסל MATLAB הרלוונטי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ניתוח תמונה-מונוקולטורה תוך שימוש בקובץ "מונוקולטורה.m" בעיקר
הערה: השלבים הבאים בוצעו באמצעות MATLAB. שלושה קבצים שימשו לפרוטוקול MATLAB: "תהליך.m" (קובץ קידוד משלים 1), הקובץ המכיל את האלגוריתם, "מונוקולטורה.m" (קובץ קידוד משלים 2), הקובץ שירוץ לניתוח תמונות מונוקולטורה, ו"coculture_modified.m" (קובץ קידוד משלים 3), הקובץ שירוץ לניתוח תמונות קוקולטורה.
<ol><li>השתמש בשיטה מבוססת האזור כדי לקבל תמונות של תאים המציגים שינויי גובה יחסיים. פלט התמונה עבור כל תת-שלב על-ידי שימוש בפונקציה 'imshow()' עבור כל תת-אימג'. העתק והדבק את קובץ התמונה לניתוח לתוך הסל והזן את שם הקובץ בפקודה הבאה. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית. imread('filename.tiff')
	<ol>
<li>נתחו תמונות על ידי 'פתיחה על ידי שחזור' ולאחר מכן 'סגירה על ידי שחזור' באמצעות פונקציות מקור8 כדי להגדיל את החזית מהרקע. השתמש בפקודה הראשונה לפתיחה על ידי שחזור וברצף השני והשלישי כדי לסגור על ידי שחזור 'imopen()' 'imerode()' 'imreconstruct()'
</li>
	</ol></li>
	<li>הפכו את התמונות המשוחזרות לפיקסלים בשחור טהור וללבן טהור תוך שימוש במערכת זיהוי מבוססת אחוזונים. שים לב שהתאים מומרים לערך פיקסלים לבן טהור של '255' במערכת זו, בעוד שרקע ואובייקטים חיצוניים (שאינם תאיים) מומרים לערך פיקסלים שחורים טהור של '0'.<ol>
<li>הבחין בין תאים לרקע על-ידי שימוש בהפרש אחוזונים מ'הפיקסל הרלוונטי המרבי', ערך הפיקסל הגדול ביותר המהווה לפחות 0.5% מתמונה נתונה.</li>
		<li>נתח והערך את ערכי הפיקסלים עבור מקרופאגים RAW264.7. אם ערכים אלה נמצאים בטווח של 4.5% מהפיקסל הרלוונטי המרבי, סמן את הפיקסל כסלולרי. הערה: ניתן להנפיק פקודה זו באמצעות משפט if פשוט.</li>
		<li>עבור תמונות המכילות פרופילים של תאים בולבוסיים, כמו אלה שנראו באיור 2, יש ליישם הליך איטרטיבי לתיקון עבור בינאריזציה שגויה במרכזי התאים (המכונים 'איים', ראו להלן), כדלקמן.</li>
		<li>קבע ניחוש ראשוני לכיסוי התא הכולל; 60% נוצלו למחקר זה. שים לב שמספר התאים הנמצאים בתמונה צריך להיות תלוי בכיסוי התא - לפיכך ניתן לקבוע את הקשר בין מספר התא לכיסוי התא באופן ניסיוני. באמצעות קשר זה, קבע את המשתנים 'אלפא' ו'קאפה'. הערה: 'אלפא' מייצג וקטור 3 על 1 המכיל את אחוזוני הגובה היחסיים הבאים: אחוזון הגובה שבו זוהו התאים, אחוזון הגובה שבו זוהה הרקע ואחוזון הגובה שבו שוכנים בדרך כלל איים-אזורים שבהם ערכי העוצמה היו נמוכים משמעותית מערכי התאים. 'קאפה' מייצג את השטח הכולל המכוסה על ידי תאים בתמונה.</li>
		<li>הפעל את האלגוריתם, אשר (1) ינתח תמונות באמצעות הערכות ראשוניות של אלפא וקפה כדי למלא חלק מהאיים, ו-(ii) ישתמש בספירת התאים הפוסטאנליזה ובכיסוי כדי לחשב מחדש את הקאפה. אם ערך הקאפה נמצא בטווח של 10% מהניחוש הראשוני, המשך לשלב הבא. הערה: עבור תמונות המכילות תאי RAW264.7 ו-NIH/3T3, נמצא כי אלפא הוא [4.3, 5.5, 10]. במילים אחרות, הבדל של 4.3% מהפיקסל הרלוונטי המרבי קבע את אחוזון הגובה שבו זוהו התאים, הבדל של 5.5% מהפיקסל הרלוונטי המרבי קבע את אחוזון הגובה שבו זוהה הרקע. הבדל של 10% מהפיקסל הרלוונטי המרבי קבע את אחוזון הגובה שבו שוכנים בדרך כלל האיים.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר בינאריזציה של התמונה, קבע את שטח התא הממוצע באופן אוטומטי באמצעות אלגוריתם חיפוש המעגלים בקוד פתוח, המבצע התמרת Hough בתמונה הבינארית 12,13,14. השתמש בפקודה הבאה כדי לקבל וקטור של כל מיקומי המרכז ורדי של עיגולים שנמצאים בתוך התמונה. '[מרכזים, רדי] = אימפינדריקל(A, [minradius, maxradius])' 'A' בפקודה זו היא התמונה הנבחרת, ו[minradius, maxradius] הוא טווח הרדיאלי שהאלגוריתם ינסה לזהות. הערה: הליך זה לקביעת שטח התא הממוצע מניח שהמורפולוגיה של תאי המקרופאג' הייתה גם מעגלית וגם עקבית בין תאים10. מנתונים ניסיוניים, הרדידי של המקרופאגים נצפים בשכיחות הגבוהה ביותר בין 30 ל-50 פיקסלים בהגדלה של פי 40. טווח פיקסלים זה מוגדר כטווח המקובל עבור אלגוריתם מציאת המעגלים. הרדידי עשוי להיות שונה באופן משמעותי עבור סוגי תאים אחרים וידרוש נחישות באמצעות ניתוח ניסיוני.<ol>
<li>השתמש ביציאות הרדיאלי כדי לחשב את שטח התא הממוצע לפי ממוצע. נתחו לפחות 10 תאים כדי להבטיח זיהוי מדויק של האזור.</li>
	</ol></li>
	<li>קבע את המספר הכולל של התאים בתוך התמונה באמצעות שטח התא הממוצע.<ol>
<li>לולאה דרך מטריצת התמונה וספור את המספר הכולל של פיקסלי התא. קבע את כיסוי התא הכולל על-ידי חלוקת מספר הפיקסלים של התא במספר הפיקסלים הכולל בתוך התמונה. קבע את המספר הכולל של התאים בתוך התמונה על-ידי חלוקת מספר הפיקסלים של התא בשטח הממוצע של התא.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניתוח תמונה-קוקולטורה תוך שימוש בקובץ "coculture_modified.m" בעיקר
הערה: השלבים הבאים בוצעו באמצעות MATLAB.
<ol><li>השתמש בשיטה מבוססת האזור כדי לקבל תמונות של תאים המציגים שינויי גובה יחסיים. פלט התמונה עבור כל תת-שלב על-ידי שימוש בפונקציה 'imshow()' עבור כל תת-אימג'. העתק והדבק את קובץ התמונה לניתוח לתוך הסל והזן את שם הקובץ בפקודה הבאה. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית. 'imread('filename.tiff')'
	<ol>
<li>נתחו תמונות על ידי 'פתיחה על ידי שחזור' ולאחר מכן 'סגירה על ידי שחזור' באמצעות פונקציות מקור10 כדי להגדיל את החזית מהרקע. השתמש בפקודה הראשונה לפתיחה על ידי שחזור וברצף השני והשלישי כדי לסגור על ידי שחזור. 'אימופן ()' 'imerode()' 'imreconstruct()'
</li>
	</ol>
</li>
	<li>בצע ניתוח של קוקולטורות המכילות תאי RAW264.7 ו- NIH/3T3 באמצעות שתי בינאריזציות סלקטיביות, המתקבלות על ידי ניצול הפרשי הגובה בין שני סוגי התאים.<ol>
<li>קבעו בניסוי פרמטר 'phi' באמצעות תמונות של תאי RAW264.7 ו-NIH/3T3, כאשר phi מייצג את הפרש הגובה היחסי בין שני סוגי התאים. נחשו ערך phi ראשוני והתחדשו עד שספירת התאים והכיסוי תואמים באופן הדוק לספירות ידניות, ספציפיות לקוקולטורה RAW264.7 ו-NIH/3T3. הערה: הערך עבור phi המשמש במחקרים אלה נמצא כ-3.2. Phi משמש לסינון סלקטיבי של תמונה כך שתופיע כמכילה רק תאי RAW264.7, כפי שניתן לראות באיור 4C.</li>
		<li>קבע את ספירת התאים של RAW264.7 ואת כיסוי התאים הכולל באופן דומה לזה של תמונות מונוקולטורה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נתחו שוב את התמונה שעברה שינוי קו פרשת המים ללא הפרמטר phi, וזיהו גם מקרופאגים וגם פיברובלסטים. רכוש נתונים פיברובלסטים של NIH/3T3 על-ידי חיסור סלקטיבי של פיקסלים של תאי RAW264.7, המתקבלים באמצעות שיטות הסף והכימות מבוססות השטח הסטנדרטיות המתוארות בשלב 2.<ol>
<li>לאחר שהתמונה כולה נותחה, קבע את המספר הכולל של פיקסלי NIH/3T3 על-ידי הפחתת המספר הכולל של פיקסלי התא ממספר הפיקסלים של RAW264.7. חשב את הכיסוי של תאי NIH/3T3 ו-RAW264.7 על-ידי חלוקה במספר הפיקסלים התאיים עבור כל שורת תא במספר הכולל של פיקסלי התמונה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+sizing+of+cells+in+microscope+images+by+template+matching+and+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Fifth+International+Conference+on+Image+Processing+and+its+Applications%2C+1995%22%5BJournal%5D)">Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection.</a> Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).</li>
<li>Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+type+cell+detection+and+counting+method+based+on+FCN%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+-+2017+IEEE+17th+International+Conference+on+Bioinformatics+and+Bioengineering+%28BIBE%29%22%5BJournal%5D)">An extended type cell detection and counting method based on FCN.</a> Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).</li>
<li>Choudhry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+method+for+automated+colony+and+cell+counting+by+digital+image+analysis+based+on+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection.</a> PLoS One. 11 (2), 0148469(2016).</li>
<li>Torre, V., Poggio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+edge+detection%5BTitle%5D)+AND+%22MIT+Artificial+Intelligence+Lab+Memo+768%22%5BJournal%5D)">On edge detection.</a> MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).</li>
<li>Fuller, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+vital+fluorescent+staining+method+for+monitoring+bacterial+transport+in+subsurface+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).</li>
<li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographic+distance+and+watershed+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Processing%22%5BJournal%5D)">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).</li>
<li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html">https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html</a> (2022).</li>
<li>Bala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+watershed+image+segmentation+technique+using+MATLAB%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Scientific+and+Engineering+Research%22%5BJournal%5D)">An improved watershed image segmentation technique using MATLAB.</a> International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).</li>
<li>Glaros, T., Larsen, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation%2C+tissue+damage+and+organ+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience+%28Landmark+Edition%29%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).</li>
<li>Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+and+fibroblast+interactions+in+biomaterial-mediated+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451(2019).</li>
<li>Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+growth+factor+gene+delivery+with+collagen-triggered+wound+repair+cascades+using+collagen-mimetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%26+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides.</a> Bioengineering & Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).</li>
<li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html">https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html</a> (2022).</li>
<li>Atherton, T., Kerbyson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+invariant+circle+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Image+and+Vision+Computing%22%5BJournal%5D)">Size invariant circle detection.</a> Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).</li>
<li>Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+Hough+transform%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Computer+Applications%22%5BJournal%5D)">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform.</a> International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).</li>
<li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Doğan, R. S., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-analysis+based+readout+method+for+biochip%3A+Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads%2C+micropads+and+patient+leukemia+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell.</a> Micron. 133, 102863(2020).</li>
<li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads+and+leukemia+cells+from+optical+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Signal+Processing+and+Control%22%5BJournal%5D)">Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images.</a> Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).</li>
<li>Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+and+astrocyte+co-culture+assay+for+high+content+analysis+of+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173(2009).</li>
<li>Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+signaling+in+co-cultures+of+macrophages+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts.</a> Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).</li>
<li>Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+implant+acceptance+and+wound+healing%3A+material+selection+and+implant+location+modulate+macrophage+and+fibroblast+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).</li>
<li>Wang, Z., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalizing+cell+segmentation+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Generalizing cell segmentation and quantification.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 189(2017).</li>
<li>Zou, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+validation+of+image+segmentation+quality+based+on+a+spatial+overlap+index%5BTitle%5D)+AND+%22Academic+Radiology%22%5BJournal%5D)">Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index.</a> Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תכננו הליך כללי מבוסס שטח שספר תאים באופן מדויק ויעיל על בסיס גובה התא, ומאפשר כמות ללא כתמים של תאים אפילו במערכות קוקולטורה. שלבים קריטיים להליך זה כללו יישום של מערכת עוצמה יחסית שבאמצעותה ניתן היה להתמיין בין תאים. השימוש בניתוח גובה יחסי שירת שתי מטרות: הצורך בפרמטרים חיצוניים הפך למיותר, שכן הפרמטרים היחסיים היו קבועים עבור סוג התא והפרמטר הנתון, ולא היה צורך להזין רמות בהירות/ניגודיות מוחלטות עבור כל תמונה. יתר על כן, השימוש במערכת מבוססת אחוזונים איפשר ניתוח של סוגי תאים מרובים בתוך אותה תמונה, בתנאי שסוגי התאים ...

התוכנה מיושמת באופן שגרתי במהלך טכניקות ניתוח תמונה כדי להבטיח שהתוצאות מדויקות, יעילות ובלתי משוחדות. עבור מבחנים מבוססי תאים, בעיה נפוצה היא זיהוי שגוי של תאים. תמונות עם הגדרות מוקד וניגודיות לא נכונות עלולות להוביל לטשטוש תאים, שבו קשה לזהות את הגבול של תאים בודדים1. נוכחות של תכונות תמונה חיצוניות כגון נקבוביות, בועות או עצמים לא רצויים אחרים עלולה לעכב הליכי ספירה על ידי האטת תהליך הספירה ולהוביל לזיהוי שגוי. יתר על כן, ספירת תאים יכולה להיות מכבידה, וספירת מאות שכפולים יכולה לגזול זמן רב. יתר על כן, הטיה סובייקטיבית מובנית קיימת במהלך הספירה הידנית, ולכן קבלת ההחלטות לגבי זיהוי תאים היא לעתים קרובות לא מדויקת2. תוכנה אוטומטית מציעה פוטנציאל מרגש לעקוף את כל הבעיות הללו על ידי הבחנה מהירה ומדויקת של תאים מאובייקטים חיצוניים, כולל עצמים הרבה מעבר ליכולת האנושית לזיהוי מדויק, בהתבסס על קריטריוני זיהוי מוגדרים היטב המפחיתים את ההשפעה של הטיית החוקרים. טכניקות נפוצות לזיהוי תאים באמצעות תוכנה אוטומטית כוללות שתי שיטות עיקריות: פילוח וסף3. בהמשך אנו מדגימים פרוטוקול מבוסס-שטח הניתן להכללה, המאפשר ספירת תאים מהירה, מדויקת וזולה במסגרת תוכנה נגישה באופן נרחב.
טכניקות סגמנטציה, כגון זיהוי קצה, מבקשות לבודד תאים בודדים על ידי שימוש בהבדלי עוצמה בתוך התמונה. שינויי עוצמה המבדילים תא משאר התמונה מורכבים לרוב משינויים חדים בבהירות4. זיהוי קצה כולל שלב סינון רגולרי, ואחריו שלב הבחנה שבו מתגלים שינויי עוצמה. תהליך ההתמיינות מזהה קצוות וקווי מתאר בתוך התמונה של שינויים בעוצמה גבוהה, וקצוות וקווי מתאר אלה מתואמים עם נוכחות התא. למרות שניתן להריץ תמונות עם רעש באמצעות אלגוריתמים המציינים4, טכניקות זיהוי קצה משמשות באופן אידיאלי לניתוח תמונות עם רעשי רקע נמוכים. התהליך מתפקד בצורה אופטימלית כאשר גבולות התא ניתנים להבחנה ברורה וקלה ואינם מונעים על ידי קווי מתאר של בהירות שאינם קשורים לנוכחות תאים, טשטוש תאים, עצמים חיצוניים או מבני תאים פנימיים מוגדרים 1,2. אם תמונה רועשת במיוחד, ניתן להבחין עוד יותר בתאים באמצעות צביעה פלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים 2,5. למרות שזה משפר באופן משמעותי את הדיוק של טכניקות סגמנטציה, זה דורש עלויות נוספות והשקעות זמן נוספות כדי להכין תרביות תאים להדמיה.
טכניקות סף כוללות חלוקה של תמונה לשתי קטגוריות: החזית והרקע, כאשר התאים מוקצים לחזית3. טכניקות אלה משתמשות בשינויי צבע/ניגודיות כדי להגדיר את הגובה הנראה לעין של אובייקט; אובייקטים שהם באופן שגרתי 'גבוהים' יותר מהרקע ניתנים לזיהוי בקלות כתאים. שינוי קו פרשת המים פועל בדרך זו על ידי שיוך משטחים עם פיקסלים בהירים כחזית ואלה עם פיקסלים כהים כרקע 6,7. באמצעות זיהוי מבוסס גובה, טכניקות סף יכולות להבחין באופן שגרתי בין רעש לאובייקטים רצויים, בתנאי שהם קיימים באותו מישור מוקד. בשילוב עם כימות מבוסס שטח, שינוי קו פרשת מים יכול לזהות במדויק קבוצות של עצמים בסביבות שבהן טכניקות סגמנטציה טיפוסיות כגון זיהוי קצה יהיו לא מדויקות.
טרנספורמציות של קו פרשת המים משולבות בדרך כלל עם טכניקות סגמנטציה כדי להכין תמונות לניתוח נקי יותר, והתוצאה היא דיוק גבוה יותר של ספירת תאים. עבור תהליך זה, שינוי קו פרשת המים משמש להדגשת אזורי עניין פוטנציאליים לפני הפילוח. התמרת קו פרשת המים מספקת יתרונות ייחודיים על-ידי זיהוי תאים בחזית התמונות, מה שיכול לשפר את הדיוק של ניתוח סגמנטציה על-ידי הסרת תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות עבור תאים, כגון כתמי רקע לא אחידים. עם זאת, קשיים יכולים להתעורר כאשר מנסים להתאים תמונות מבוססות תאים לשינוי קו פרשת המים. תמונות עם צפיפות תאים גבוהה עלולות להיות נגועות בתת-סגידה, שבה אגרגטים של תאים מזוהים כקבוצה סינגולרית ולא כמרכיבים בודדים. נוכחות של רעש או שינויי עוצמה חדים יכולה גם לגרום לטענת יתר, שבה האלגוריתם מרחיב את התאים יתר על המידה, וכתוצאה מכך ספירת תאים מוגזמת ולא מדויקת8.
בהמשך, אנו מפרטים שיטה למזער את החסרונות העיקריים של התמרת קו פרשת המים על ידי שילוב רכיבים של ניתוח סף בתוך אלגוריתם כימות מבוסס שטח, כפי שמתואר באיור 1. יש לציין כי אלגוריתם זה יושם עם תוכנות קוד פתוח ו/או זמינות באופן נרחב, ויישום של מסגרת ספירת תאים זו התאפשר ללא ריאגנטים יקרים או טכניקות מורכבות להכנת תאים. מקרופאגים RAW264.7 שימשו להדגמת השיטה בשל תפקידם הקריטי בוויסות תחזוקת רקמות חיבור ותהליכי ריפוי פצעים9. בנוסף, פיברובלסטים NIH/3T3 נותחו בשל תפקידם המרכזי בתחזוקה ותיקון של רקמות. תאים פיברובלסטים מתקיימים לעתים קרובות יחד עם מקרופאגים ותומכים בהם, מה שיוצר את הצורך להבחין בין סוגי תאים מובחנים פנוטיפיים אלה במחקרי קוקולטורה.
ניתן לכמת את ספירת התאים מתמונות בעלות צפיפות תאים בת קיימא גבוהה (VCD) באופן אמין ויעיל על-ידי חישוב השטח המכוסה על-ידי התאים, והאזור הממוצע שתופס תא יחיד. השימוש בסף לעומת סגמנטציה לזיהוי תאים איפשר גם ניתוחים מורכבים יותר, כגון ניסויים שבהם נותחו סוגי תאים שונים בקוקולטורות במקביל. פיברובלסטים NIH/3T3, שלעתים קרובות נמצא כי הם מתמזגים עם מקרופאגים RAW264.7 בתוך אתר ריפוי פצעים, נמצאו כמיגדלים במישור מוקד שהיה נבדל ממישור המוקד של המקרופאגים10. בהתאם לכך, הופעלו מספר אלגוריתמי סף כדי להגדיר את הרקע והחזית בהתאם לסוג התא המנותח, מה שמאפשר ספירה מדויקת של שני סוגי תאים שונים בתוך אותה תמונה.

<table><tbody><tr><td>Axio Observer 7 מיקרוסקופ הפוך</td><td>Zeiss</td><td>1028290770</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>מגרדי תאים</td><td>CellTreat</td><td>229310</td><td></td></tr><tr><td>Dublecco's Modified Eagle Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12430047</td><td></td></tr><tr><td>14190144 PBS Fisher Scientific של Dublecco</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB תוכנה</td><td>MathWorks</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>תאי NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL - 1658</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין&ndash; סטרפטומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P4333-20 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 תאים</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB - 71</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S6014-25G</td><td></td></tr><tr><td>T75 בקבוק תרבית תאים</td><td></td><td>CLS3814-24EA</td><td></td></tr></tbody></table>

אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

כימות התאים נחוץ למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים וביוכימיים. ניתוח תמונה קונבנציונלי של תאים משתמש בדרך כלל בגישות לזיהוי פלואורסצנטי, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים או טכניקות לזיהוי קצה, שלעתים קרובות מועדות לשגיאות עקב רעש ואי-אידיאליות אחרות ברקע התמונה. 
תכננו אלגוריתם חדש שיכול לספור ולהבחין במדויק מקרופאגים ופיברובלסטים, תאים בעלי פנוטיפים שונים שלעתים קרובות קולוקליים במהלך התחדשות רקמות. MATLAB שימש ליישום האלגוריתם, אשר הבדיל בין סוגי תאים נפרדים בהתבסס על הבדלי גובה מהרקע. אלגוריתם ראשוני פותח בשיטה מבוססת שטח כדי להסביר שינויים בגודל/מבנה התא ובתנאי זריעה בצפיפות גבוהה. 
אי-אידיאליות במבני תאים נלקחה בחשבון באמצעות אלגוריתם משני, איטרטיבי, המשתמש בפרמטרים פנימיים כגון כיסוי תאים המחושב באמצעות נתונים ניסיוניים עבור סוג תא נתון. לבסוף, ניתוח של סביבות קוקולטורה בוצע באמצעות אלגוריתם בידוד שבו סוגי תאים שונים לא נכללו באופן סלקטיבי על סמך הערכה של הבדלי גובה יחסיים בתוך התמונה. נמצא כי גישה זו סופרת במדויק תאים בתוך מרווח שגיאה של 5% עבור תאים חד-תרבותיים ובתוך מרווח שגיאה של 10% עבור תאים קוקולטורים.

ניתוח של מקרופאגים RAW264.7 שאינם בולבוסיים נערך במסגרת מונוקולטורה של 25,000 תאים/ס"מ2. תמונות מייצגות צולמו של תרבית התאים ועובדו ב- MATLAB לאחר המרה ל- tiff של 8 סיביות ב- ImageJ. פלטי האלגוריתם לאורך כל התהליך תועדו ותועדו באיור 2 עבור התמונה המייצגת. בתמונה זו, האלגוריתם ספר 226 תאים, וספירת תמונות זו אומתה על ידי השוואה לספירה ידנית שזיהתה 241 תאים (שגיאה של 6.2%). פלטי האלגוריתם עבור לפחות 10 תמונות של ספירת תאים RAW264.7 היו בעלי שגיאה ממוצעת של 4.5 ±-1.9%.
<p class="j...

אנו מציגים שיטה, המשתמשת בגישת ניתוח תמונות מבוססת שטח הניתנת להכללה כדי לזהות את ספירת התאים. ניתוח של אוכלוסיות תאים שונות ניצל את ההבדלים המשמעותיים בגובה התא ובמבנה בין סוגי תאים שונים בתוך אלגוריתם אדפטיבי.

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

שיטה זו יכולה לשמש כדי לסייע לחוקרים לנתח ולספור תרביות משותפות של תאים באמצעות ניתוח פשוט ויעיל המבוסס על שטח. טכניקה זו קלה יחסית ליישום באמצעות תוכנה זמינה באופן נרחב ומציעה אמצעי אמין ומדויק לזיהוי סוגי תאים שונים במסגרת תרבית משותפת. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האופן שבו תרביות משותפות ספציפיות של תאים משתלבות כדי לסייע בהתחדשות רקמות.ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לאמת מחקרי סמנים ביולוגיים של מונוקולטורה. בתור התחלה, תרבית גולמית 264.7 מקרופאגים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני להדמיית מונוקולטורה במיליליטר אחד של DMEM בתוספת FBS, פניצילין-סטרפטומיצין, נתרן ביקרבונט ובטא-מרקפטואתנול בבקבוקון תרבית תאים של חמישה מיליליטר בצפיפות של 25, 000 תאים לסנטימטר מרובע. תאי NIH/3T3 תרבית ב-DMEM בתוספת 10% FBS ו-1%פניצילין-סטרפטומיצין.עבור הדמיה של תרבית משותפת, תרבית גולמית 264.7 מקרופאגים ופיברובלסטים NIH/3T3 באמצעות מדיום תרבית משותפת המכיל חלק אחד גולמי 264.7 בינוני וחלק אחד NIH/3T3 בינוני יחד ביחסים מגוונים וצפיפות כוללת של 25, 000 תאים לסנטימטר מרובע. לאחר הזריעה, הדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני כדי להגיע לצפיפות תאים בת קיימא של 80% מפגש תאים. כדי להשיג תמונות של תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה של 40X, קבע את יכולת האלגוריתם להעריך במדו

area-based-image-analysis-algorithm-for-quantification-macrophage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterns דבק כי לנרמל ארכיטקטורה הסלולרי יכול לשמש כדי להגביר את הרגישות של זיהוי של השפעות התרופה, לשפר reproducibility ולפשט רכישת התמונה ניתוח אוטומטי. טכנולוגיה זו ייהנו סמים / siRNA מבחני המיון, שבוצעה על התרבות תומך קונבנציונלי התא וכתוצאה מכך סובל השתנות התא אל התא מוגזמת.

ויזואליזציה שיפור ניתוח כמותי של השפעות התרופה באמצעות תאים micropatterned

שיטה חדשנית להשיג מקרופאגים מתרבות העיקרי של תאים בכבד חולדה מתואר. שיטה זו מנצלת את ריבוי של מקרופאגים בתרבות, ואחריו רעד של צלוחיות תרבות וטיהור על ידי התקשרות סלקטיבית מנות פלסטיק. טכניקה זו יעילה מספק מקרופאגים הכבד ללא ציוד מיומנויות מורכבות.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

התמיינות תאים מוסדרת על ידי שורה של גורמי microenvironmental, כוללים שני תכונות חומר רכב מצע מטריקס. אנו מתארים כאן טכניקת ניצול microarrays תא בשיתוף עם מיקרוסקופ כוח המתיחה להעריך הן התמיינות תאי אינטראקציות תא-מצע ביומכנית כפונקציה של הקשר microenvironmental.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

הגששים במטרה לייצג כלי חדשני עבור ניתוח המנגנונים המולקולריים, כגון חלבון ביטוי בסוגים שונים של המחלה (למשל, דלקת, זיהום, ו- tumorigenesis). במחקר זה, אנו מתארים הערכה כמותית טומוגרפי תלת מימדי של הסתננות מקרופאג מעיים במודל מאתר של קוליטיס באמצעות טומוגרפיה בתיווך פלורסצנטיות F4/80-ספציפיות.

בתיווך פלורסצנטיות טומוגרפיה זיהוי, כימות הקשורות מקרופאג דלקת מעיים מאתר

מיקרוגלייה הם תאים חיסוניים המוח כי סקר ולהגיב המוח שינו פיסיולוגיה באמצעות שינויים מורפולוגיות אשר עשויים להעריך באופן כמותי. זה מתאר פרוטוקול ImageJ מבוסס פרוטוקול ניתוח כדי לייצג מיקרוגלייה מורפולוגיה רציפה לנתונים על פי מדדים כגון הסתעפויות תא, המורכבות צורה.

לכימות מיקרוגלייה מורפולוגיה של Photomicrographs של אימונוהיסטוכימיה מוכן רקמות באמצעות ImageJ

כאן, אנו מתארים אסטרטגיה פשוטה ונגישה להמחיש, לכמת, ומיפוי תאים חיסוניים ב-formalin-קבוע פרפין מוטבע רקמת הגידול סעיפים. מתודולוגיה זו משלבת הדמיה קיימת טכניקות ניתוח דיגיטלי עם המטרה של הרחבת יכולת ריבוב וניתוח רב פרמטרים של הדמיה מספר.

הדמיה, קוונפיקציה, ומיפוי של אוכלוסיות תאים החיסונית במיקרו סביבה הגידול

המאמר מתאר את הכמת של 1) את גודל ומספר של הידעיות מיקוד ו 2) אינדקס צורת תא ואת ההתפלגות שלה מתוך תמונות קונפוקלית וקד של המונאולאיירס הקונאולית של תאים MCF7.

קוונפיקציה של אזור הדבקה בתשתית התא והפצות צורות התא ב-MCF7 Cell Monolayers

בעידן האימונותרפיה והפרופיל הגנומי של התא הבודד, ביולוגיה של סרטן דורשת כלים חדשניים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני נכון. אנו מתארים פרוטוקולים לניצול תרביות מיקרופלואידיות מיקרופלואידיות של גידולים חיסוניים בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, התואמים לניטור דינמי ורב-פרמטרי של תפקודים תאיים.

מודלים של תרבית משותפת מיקרופלואידית לניתוח התגובה החיסונית במיקרו-סביבות גידוליות במבחנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקירת האינטראקציה של מקרופאגים ראשוניים שמקורם במונוציטים אנושיים עם ספרואיד גידול במטריצת קולגן I תלת מימדית (תלת מימדית), עם אפשרות להשוות את ההשפעה של תכונות מסיסות ופיזיקליות של המיקרו-סביבה על פלישת התאים.

בדיקת פלישה משותפת של מקרופאגים-גידול ספרואידים

פרוטוקול זה מתאר תהליך עבודה מבוסס טומוגרפיה דיפרקציה אופטית ללא תוויות להדמיה בזמן אמת וניתוח כמותי של מורפודינמיקת מקרופאג'ים. השיטה מאפשרת מעקב רציף אחר מורפולוגיה והגירה של תא יחיד, ומספקת מדידות מתוכננות בזמן של שטח, היקף ומהירות נדידה ממוצעת במהלך הדמיה ארוכת טווח של תאים חיים.

הדמיה בזמן אמת ללא תוויות וניתוח כמותי של מורפודינמיקת מקרופאגים באמצעות טומוגרפיית דיפרקציה אופטית

פרוטוקול זה מתאר שיטת דימות תאים חיים בשיטת time-lapse להדמיית פגוציטוזה של תאי סרטן שד טריפל-נגטיב המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק על ידי מקרופגים תלויי-נוגדנים, תוך שימוש במקרופגים המופקים מתאי דם פריפריים חד-גרעיים (PBMC) ובמיקרוסקופ אוטומטי.

דימוי בשקיעת זמן (Time-Lapse Imaging) של פגוציטוזה של תאי סרטן שד טריפל-נגטיב המסומנים בחלבון פלואורסצנציה ירוק על ידי מקרופאגים בהנחיית נוגדנים

למד שיטת ניתוח תמונה מבוססת אזור לכימות תרביות משותפות של תאים. השיטה מבדילה בין Raw 264.7 מקרופאגים לתאי NIH/3T3 פיברובלסטים ומספקת תובנות לחידוש רקמות.

אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים

גלה סרטונים נוספים