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Articolo di ricerca

Analisi integrate di trascrittomica bulk, a singola cellula e spaziale identificano PPARG come gene prognostico candidato correlato alla senescenza nell'osteosarcoma

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DOI:

10.3791/73062

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25 settembre 2026

 ,  ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine Department, Liuzhou People's Hospital, 2Spinal Surgery Department, Liuzhou People's Hospital, 3Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Utilizzando analisi trascrittomique bulk, di singola cellula e spaziali, insieme a modelli predittivi di sopravvivenza basati sull'apprendimento automatico e a una validazione sperimentale, questo studio propone PPARG come gene prognostico candidato associato alla senescenza nell'osteosarcoma, collegando la sua ridotta espressione a un esito sfavorevole in termini di sopravvivenza nel TARGET-OS e a caratteristiche vascolari e del microambiente.

Abstract

L'osteosarcoma rimane una patologia difficile da trattare nei casi metastatici, ricorrenti o resistenti alla terapia. Questo studio ha avuto lo scopo di identificare geni prognostici legati alla senescenza e di caratterizzarne i contesti spaziali. È stata effettuata un'analisi differenziale di espressione accoppiata nel dataset GSE99671 utilizzando DESeq2, seguita dall'intersezione con il set genico di senescenza CellAge. I dati trascrittomici del coorte TARGET-OS sono stati ottenuti da UCSC Xena. I geni candidati sono stati valutati mediante regressione di Cox univariata, analisi di Kaplan-Meier, analisi della caratteristica operativa del ricevitore dipendente dal tempo, regressione di Cox con metodo LASSO, analisi LASSO ripetute e modellizzazione con random survival forest, incorporando covariate cliniche nei modelli di Cox aggiustati. Arricchimento funzionale, analisi del microambiente immunitario, trascrittomica a singola cellula, trascrittomica spaziale SP_BS3, validazione dell'espressione in GSE36001 e validazione mediante qRT-PCR e Western blot in cellule di osteosarcoma 143B e cellule osteoblastiche sono stati utilizzati per la caratterizzazione. In GSE99671, 2.248 geni sono risultati differenzialmente espressi con P aggiustato < 0,05, e l'intersezione con i 866 geni CellAge ha prodotto 105 geni differenzialmente espressi legati alla senescenza. Nel coorte TARGET-OS, un'espressione più bassa di PPARG era associata a un rischio maggiore di mortalità (HR univariata = 0,603, IC 95% = 0,454–0,802, P = 0,000494; HR aggiustata = 0,224, IC 95% = 0,085–0,589, P = 0,00241). L'aggiunta di PPARG al modello clinico ha aumentato l'indice C da 0,707 a 0,829. PPARG risultava sotto-regolato sia in GSE99671 che in GSE36001, e qRT-PCR e immunoblotting hanno confermato una minore espressione di mRNA e proteina PPARG nelle cellule di osteosarcoma 143B rispetto alle cellule osteoblastiche. L'analisi a singola cellula ha localizzato PPARG in cellule endoteliali, periciti, macrofagi/monociti e cellule stromali associate al tumore. L'analisi trascrittomica spaziale ha mostrato correlazioni positive deboli ma significative tra l'espressione di PPARG e i punteggi relativi alla senescenza CellAge, alle cellule endoteliali e ai periciti. Questi risultati indicano PPARG come un biomarcatore prognostico candidato derivato da CellAge, associato a una sopravvivenza sfavorevole e a caratteristiche del microambiente vascolare nell'osteosarcoma, sostenendo ulteriori indagini sulla sua potenziale rilevanza nella stratificazione del rischio e nel microambiente tumorale legato alla senescenza. GSE36001 ha fornito soltanto una validazione esterna dell'espressione; non è stata effettuata una validazione indipendente della sopravvivenza.

Introduzione

L'osteosarcoma è il tumore osseo maligno primitivo più comune nei bambini, negli adolescenti e nei giovani adulti1. Sebbene la chemioterapia con più agenti combinata alla chirurgia abbia migliorato i risultati nei casi localizzati2,3, i pazienti con osteosarcoma metastatico, ricorrente o resistente alla terapia continuano ad avere una scarsa sopravvivenza a lungo termine3,4. Evidenze recenti indicano che la rimodellazione epigenetica indotta dallo stress ossidativo può favorire l'adattamento metastatico e la progressione tumorale, evidenziando la complessa plasticità molecolare alla base dei fenotipi tumorali aggressivi5. Biomarcatori robusti, al contempo interpretabili clinicamente e informativi dal punto di vista biologico, rimangono limitati. Pertanto, risulta fondamentale identificare caratteristiche molecolari in grado di catturare l'eterogeneità dell'osteosarcoma e il rischio prognostico attraverso multipli livelli di dati.

La senescenza cellulare è un programma di arresto stabile del ciclo cellulare indotto da disfunzione dei telomeri, danni al DNA, stress ossidativo, attivazione di oncogeni e pressione terapeutica6. La senescenza può limitare la proliferazione anomala; tuttavia, le cellule senescenti possono anche rimodellare il microambiente tumorale attraverso programmi infiammatori, chemochine, fattori di crescita e rimodellamento della matrice extracellulare7,8. Nell'osteosarcoma, i geni associati alla senescenza possono riflettere sia stati di stress intrinseci alle cellule tumorali sia compartimenti microambientali non maligni, ma la loro rilevanza prognostica e organizzazione spaziale non sono state ancora valutate sistematicamente.

PPARG codifica il recettore nucleare attivato da proliferatori di perossisomi gamma, un recettore nucleare attivato da ligandi coinvolto nel metabolismo dei lipidi, nella regolazione dell'infiammazione, nella differenziazione cellulare e nella modulazione immunitaria9. Il ruolo di PPARG nel cancro dipende dal contesto10. In alcuni contesti, PPARG è associato a stati di differenziazione e anti-infiammatori, mentre in altri può sostenere programmi tumorali o stromali adattativi. Tuttavia, il suo profilo di espressione, il valore prognostico e la localizzazione cellulare e spaziale nell'osteosarcoma non sono ancora completamente caratterizzati.

Nello studio attuale, sono stati identificati i geni differenzialmente espressi in GSE99671 e incrociati con il set genico di senescenza CellAge, ottenendo 105 geni differenzialmente espressi associati alla senescenza. Successivamente, sono stati utilizzati i dati di sopravvivenza di TARGET-OS, diversi approcci di modellizzazione della sopravvivenza e di machine learning, e un aggiustamento clinico per identificare PPARG come gene centrale. PPARG è stato ulteriormente caratterizzato mediante analisi funzionali su dati bulk e analisi del microambiente immunitario, trascrittomica single-cell, trascrittomica spaziale, convalida esterna dell'espressione da GSE36001 e convalida mediante qRT-PCR e Western blot nella linea cellulare di osteosarcoma 143B e negli osteoblasti umani.

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Protocollo

Questo studio ha utilizzato set di dati pubblici e linee cellulari per l'analisi e la validazione e non ha coinvolto partecipanti umani o campioni di tessuto clinico; pertanto, non era richiesta l'approvazione etica.

Analisi dell'espressione differenziale nell'intersezione tra GSE99671 e CellAge
I dati di conteggio grezzi e le informazioni sul raggruppamento dei campioni per GSE99671 sono stati ottenuti da GEO11,12. Sono state analizzate diciotto coppie di campioni di osteosarcoma e tessuti normali abbinati. È stata eseguita un'analisi dell'espressione differenziale accoppiata utilizzando DESeq2 con la formula di progettazione ~ pair_id + condition, in cui pair_id tiene conto degli effetti individuali accoppiati e condition confronta il tessuto tumorale con il tessuto normale13. Sono stati mantenuti i geni con conteggi di letture di almeno 10 in almeno tre campioni. L'espressione differenziale è stata definita come un valore di P corretto < 0,05, ed è stata applicata una soglia più rigorosa di valore di P corretto < 0,05 e |log2FC| ≥ 1 per la visualizzazione. I geni con espressione differenziale sono stati incrociati con i 866 geni di senescenza di CellAge dopo aver convertito i simboli genici in maiuscolo14. L'analisi dell'espressione differenziale è stata eseguita in R (versione 4.3.2) utilizzando DESeq2 (versione 1.40.2), e i valori di P corretti sono stati calcolati mediante il metodo di Benjamini-Hochberg.

Cohorte TARGET-OS e modellizzazione prognostica
I dati trascrittomici e clinici della coorte TARGET-OS sono stati ottenuti da UCSC Xena15. Sono stati estratti i valori di espressione per i 105 geni differenzialmente espressi associati alla senescenza. Sono stati inclusi 85 pazienti con dati completi riguardo al tempo di sopravvivenza, allo stato di sopravvivenza e all'espressione dei geni candidati, con 27 eventi di decesso. I valori standardizzati di espressione genica sono stati analizzati mediante regressione di Cox univariata16, analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier e analisi ROC (caratteristica operativa del ricevitore) dipendente dal tempo17. Sono state utilizzate la regressione di Cox con penalizzazione LASSO18, l'analisi ripetuta della stabilità LASSO e il modello random survival forest per valutare la stabilità della selezione e l'importanza delle variabili19. Il punteggio integrato dell'hub e il ranking integrato clinico sono stati calcolati utilizzando i criteri binari espliciti descritti di seguito. Le analisi di sopravvivenza sono state eseguite in R mediante i pacchetti survival (versione 3.5-7), timeROC (versione 0.4), glmnet (versione 4.1-8) e randomForestSRC (versione 3.2.2). Per la selezione iniziale univariata di Cox sui 105 geni candidati, è stata applicata la correzione del tasso di falsa scoperta (FDR) di Benjamini-Hochberg, e i geni con FDR < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.

Pre-elaborazione del modello, raggruppamento di PPARG e analisi ROC dipendente dal tempo
Tra 85 pazienti con 27 decessi, i geni con varianza nulla sono stati esclusi, i valori mancanti di espressione dei geni candidati sono stati sostituiti con la mediana e l'espressione di ciascun gene candidato è stata standardizzata con il punteggio z. Per l'analisi di Kaplan-Meier, l'espressione è stata dicotomizzata in base alla mediana del gruppo: i valori strettamente superiori alla mediana sono stati assegnati al gruppo ad alta espressione, mentre i valori uguali o inferiori alla mediana al gruppo a bassa espressione (PPARG: n = 42 alto e n = 43 basso). I test del log-rank erano a due code. Le analisi ROC dipendenti dal tempo hanno utilizzato timeROC con causa dell'evento = 1, pesatura marginale inversa della probabilità di censura, tempi di valutazione di 365, 1.095 e 1.825 giorni e iid = FALSE. Per garantire che valori più elevati del marcatore indichino sempre un rischio maggiore, sono stati utilizzati i valori di espressione standardizzati per i geni con coefficienti di Cox positivi e moltiplicati per -1 per i geni protettivi con coefficienti negativi.

LASSO e LASSO ripetuto
Il modello Cox LASSO è stato adattato utilizzando glmnet con family = "cox", alpha = 1, standardizzazione preliminare dei punteggi z (quindi standardize = FALSE), cross-validation a cinque ripetizioni, type.measure = "deviance" e seme casuale 123. La soluzione principale dei coefficienti ha utilizzato lambda.min. L'analisi di stabilità ha ripetuto la stessa cross-validation a cinque ripetizioni 300 volte; per la ripetizione b è stato utilizzato il seme 1000 + b (b = 1,...,300). Per ogni gene, la frequenza di selezione corrispondeva alla proporzione di ripetizioni con un coefficiente diverso da zero a lambda.min; è stata inoltre registrata la selezione diversa da zero a lambda.1se.

Foresta di sopravvivenza casuale
Una foresta di sopravvivenza è stata adattata a tutti i 105 geni candidati standardizzati utilizzando randomForestSRC (versione 3.2.2), con seme 123, ntree = 1.000, importance = TRUE e na.action = "na.impute". Sono stati mantenuti i valori predefiniti del pacchetto per i dati di sopravvivenza: suddivisione basata sul log-rank, mtry = 11 (il valore superiore della radice quadrata di 105 predittori), dimensione minima del nodo terminale = 15, nsplit = 10 punti di suddivisione casuali, campionamento senza reimmissione con frazione di campionamento 0,632 e importanza delle variabili con metodo anti-split.

Punteggio integrato dell'hub
Ciascuno dei 105 geni candidati differenzialmente espressi associati a CellAge ha ricevuto un punto per ognuno dei sei criteri binari: (1) appartenenza all'intersezione espressione differenziale/CellAge (tutti i candidati hanno ottenuto questo punto poiché era richiesto un valore di P corretto < 0,05 prima dell'assegnazione del punteggio); (2) valore di P univariato di Cox nominale < 0,05; (3) valore di P del test log-rank di Kaplan-Meier < 0,05; (4) AUC media dipendente dal tempo a 3 e 5 anni ≥ 0,65; (5) frequenza di selezione lambda.min nel LASSO ripetuto pari o superiore al 70° percentile tra i candidati e > 0; e (6) importanza nel random survival forest pari o superiore al 70° percentile tra i candidati e > 0. Tutti i criteri avevano un peso unitario uguale, producendo un punteggio dell'hub compreso tra 0 e 6; i geni con punteggio ≥ 4 sono stati selezionati per l'aggiustamento clinico (18 geni). Sono stati inoltre riportati i valori FDR di Cox univariato, e il valore FDR < 0,05 è stato utilizzato per indicare la significatività per confronti multipli, ma l'indicatore di punteggio predeterminato ha utilizzato il valore di P nominale < 0,05.

Classificazione integrata clinica
Dopo aver unito i dati di espressione e quelli clinici, le analisi aggiustate hanno incluso 40 pazienti con dati completi sui covarianti e 13 decessi. Il punteggio finale corrispondeva al punteggio iniziale della centralità (hub score) più un punto per ciascuno dei sette criteri seguenti: valore di P aggiustato di Cox < 0,05, valore di P aggiustato di Cox < 0,10, valore di P di Cox per la sensibilità < 0,05 dopo l'esclusione della chirurgia definitiva, valore di P di Cox per la sensibilità < 0,10, AUC media a 3 e 5 anni ≥ 0,65, valore di P del test del rapporto di verosimiglianza < 0,10 per il modello clinico-più-gene rispetto al modello solo clinico e delta AIC < 0. Poiché le soglie 0,05 e 0,10 erano annidate, un valore di P < 0,05 contribuiva con due punti, attribuendo così un peso maggiore alle evidenze di Cox aggiustate e di sensibilità chiaramente significative. Il punteggio totale variava da 0 a 13; in caso di parità, la posizione era determinata dal valore di P aggiustato di Cox più basso, seguito dall'AUC media a 3/5 anni più alta. PPARG ha ottenuto tutti e sei i punti iniziali e tutti e sette i punti di integrazione clinica (13/13), piazzandosi al primo posto. Il miglioramento dell'indice C è stato riportato in forma descrittiva e non è stato assegnato alcun punteggio.

Aggiustamento clinico
I geni hub candidati sono stati integrati con le variabili cliniche del TARGET-OS, tra cui sesso, età, stato della malattia alla diagnosi, sito primario del tumore, regione tumorale specifica e intervento chirurgico definitivo. Quaranta pazienti con dati completi di espressione e cartelle cliniche, inclusi 13 decessi, sono stati inclusi nelle analisi aggiustate per variabili cliniche. I modelli di Cox contenenti solo variabili cliniche sono stati confrontati con modelli che includevano variabili cliniche più l'espressione genica. Il valore C, il criterio informativo di Akaike (AIC) e i valori P del test del rapporto di verosimiglianza sono stati utilizzati per valutare il miglioramento del modello. È stata effettuata un'analisi di sensibilità dopo la rimozione della variabile relativa all'intervento chirurgico.

Analisi dell'arricchimento funzionale e del microambiente immunitario
I campioni di TARGET-OS sono stati stratificati in base all'espressione di PPARG. L'espressione differenziale tra i gruppi PPARG-alto e PPARG-basso è stata utilizzata per generare liste geniche ordinate per l'analisi di arricchimento dei set di geni (GSEA)20. I percorsi mostrati sono: Nemeth Inflammatory Response LPS Up, Burton Adipogenesis 5, Burton Adipogenesis 6, Krieg KDM3A Targets Not Hypoxia, Reactome: Transcriptional Regulation By TP53, Fulcher Inflammatory Response Lectin Vs LPS Dn, Hollmann Apoptosis Via CD40 Dn, Zhou Inflammatory Response Live Dn, WP: Fatty Acids And Lipoproteins Transport In Hepatocytes, Sweet Lung Cancer KRAS Up, KEGG Medicus Pathogen HIV Tat To TLR2/4 NF-kB Signaling Pathway e Reactome: Fatty Acids. È stato calcolato un punteggio di senescenza CellAge su dati bulk e l'analisi della correlazione di Spearman è stata utilizzata per valutare le associazioni tra PPARG e geni della senescenza o firme del microambiente immunitario21. Le differenze nei punteggi del microambiente tra i gruppi PPARG-alto e PPARG-basso sono state valutate mediante test non parametrici con correzione per confronti multipli.

Analisi trascrittomica a singola cellula
Un dataset trascrittomica a singola cellula pubblicato sul sarcoma osteogenico umano è stato analizzato utilizzando un oggetto preelaborato per il quale il controllo di qualità, la riduzione della dimensionalità, il clustering e l'annotazione manuale erano già stati completati22,23,24. Sono state incluse complessivamente 68.336 cellule e 32.297 geni. Per l'interpretazione del testo principale, le annotazioni sono state semplificate in 13 tipi cellulari principali: cellule B, CAF, cellule in ciclo, cellule endoteliali, cellule eritroidi, macrofagi/monociti, cellule maligne del sarcoma osteogenico, cellule miogeniche, neutrofili, cellule simili agli osteoclasti, periciti, cellule T/NK e cellule stromali associate al tumore. La riduzione della dimensionalità, l'espressione delle caratteristiche, i grafici a punti e i grafici a violino sono stati utilizzati per visualizzare la localizzazione di PPARG. Le cellule positive per PPARG sono state definite come cellule con espressione maggiore di zero. Le differenze tra i tipi cellulari sono state valutate mediante test di Kruskal-Wallis e test della somma dei ranghi di Wilcoxon con correzione di Benjamini-Hochberg. Le analisi a singola cellula sono state eseguite in R utilizzando Seurat (versione 5.0.1).

Analisi trascrittomica spaziale
Il campione trascrittomica spaziale SP_BS3 è stato utilizzato per costruire un oggetto di espressione spaziale25,26. Le soglie di controllo qualità erano nFeature_Spatial ≥ 200 e percent.mt ≤ 30, lasciando 4.572 spot per l'analisi. I dati sono stati normalizzati, sono stati selezionati 3.000 geni altamente variabili e sono state eseguite la scalatura dei dati, l'analisi delle componenti principali, la costruzione del grafo di vicinato, il clustering spaziale degli spot e la riduzione della dimensionalità. Un punteggio spaziale di senescenza CellAge è stato calcolato dopo aver rimosso PPARG dal set genico per evitare una correlazione circolare. Sono state costruite e valutate le firme di endoteliali, periciti, macrofagi/monociti, stromali associati al tumore, osteosarcomi maligni e simili agli osteoclasti. È stata utilizzata l'analisi della correlazione di Spearman per valutare le associazioni tra l'espressione di PPARG e i punteggi spaziali. Il trasferimento di etichetta è stato effettuato utilizzando il dataset singola-cellula come riferimento e il dataset spaziale come query per inferire i punteggi previsti per tipo cellulare per ogni spot23,24. Le analisi trascrittomiche spaziali sono state eseguite in R utilizzando Seurat (versione 5.0.1) e la correzione FDR di Benjamini-Hochberg è stata applicata a tutti i valori P di correlazione spaziale.

Convalida dell'espressione esterna in GSE36001
Il set di dati GEO GSE36001 è stato utilizzato esclusivamente come coorte indipendente per la convalida dell'espressione; poiché i dati sugli esiti di sopravvivenza non erano disponibili, non è stato impiegato per la convalida prognostica11,27. Il set di dati comprendeva 19 campioni di osteosarcoma e sei campioni di controllo normali. È stata utilizzata l'annotazione della piattaforma GPL6102 per convertire gli identificatori delle sonde in simboli genici. Quando più sonde corrispondevano allo stesso gene, è stata mantenuta quella con l'espressione media più elevata. L'espressione differenziale tra i gruppi tumorali e normali è stata valutata mediante limma28. Le analisi sono state eseguite in R utilizzando limma (versione 3.56.2) e i valori di P aggiustati sono stati calcolati con il metodo di Benjamini-Hochberg.

Validazione mediante qRT-PCR e Western blot
La validazione sperimentale è stata eseguita utilizzando la linea cellulare di osteosarcoma umano 143B e cellule di osteoblasti umani. Le cellule di osteosarcoma sono state coltivate in mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO₂, e passate con tripsina-EDTA 0,25% al raggiungimento di una confluenza dell'80–90%. Le cellule di osteoblasti umani sono state mantenute nelle condizioni di coltura raccomandate. Tutte le linee cellulari sono state verificate per l'assenza di contaminazione da micoplasma. Per la qRT-PCR, l'RNA totale è stato estratto utilizzando un reagente per l'estrazione dell'RNA a base di fenolo-guanidinio, e la concentrazione e la purezza dell'RNA sono state valutate mediante spettrofotometria. Un microgrammo di RNA totale è stato retrotrascritto utilizzando un reagente per la retrotrascrizione seguendo il protocollo raccomandato. La qRT-PCR è stata eseguita impiegando una chimica basata su colorante fluorescente legante il DNA, con le seguenti condizioni di ciclatura: denaturazione iniziale a 95 °C per 30 s, seguita da 40 cicli a 95 °C per 5 s e 60 °C per 30 s, con analisi della curva di denaturazione per confermare la specificità dell'amplificazione. Ogni reazione è stata eseguita in triplicato tecnico e sono stati condotti tre esperimenti biologici indipendenti. Il gene GAPDH è stato utilizzato come controllo interno e l'espressione relativa di PPARG è stata calcolata con il metodo 2-ΔΔCt29. Il primer forward per PPARG era 5'-CGAAGACATTCCATTCACAAGAACAG-3', mentre il primer reverse era 5'-AGATGCAGGCTCCACTTTGATTG-3'.

Il Western blot è stato eseguito per analizzare l'espressione proteica di PPARG. Le cellule sono state lisate in buffer per saggio di radioimmunoprecipitazione supplementato con inibitori delle proteasi e le concentrazioni proteiche sono state determinate mediante saggio con acido bicinconinico. Quantità uguali di proteina (30 µg per pozzetto) sono state separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di dodecilsolfato di sodio al 10% e trasferite su membrane di difluoruro di polivinilidene. Dopo il blocco con latte scremato al 5% per 1 h a temperatura ambiente, le membrane sono state incubate tutta la notte a 4 °C con anticorpi primari contro PPARG (1:1.000) e GAPDH (1:5.000), seguiti dall'incubazione con un anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (1:5.000) per 1 h a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state visualizzate mediante rilevamento chemiluminescente, e sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti. Le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando un software di analisi delle immagini30. Le differenze tra i gruppi sono state analizzate utilizzando il test t di Student non appaiato a due code t test. I dati sono stati presentati come media ± deviazione standard (DS) di tre esperimenti indipendenti, e P < Un valore di 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Le analisi statistiche dei dati sperimentali sono state effettuate utilizzando un software di analisi statistica (versione 9.0).

Analisi statistica
Se non diversamente specificato, tutte le analisi bioinformatiche sono state eseguite in R (versione 4.3.2). Bilaterali P valori < 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi. Le correlazioni sono state valutate utilizzando il coefficiente di correlazione rank di Spearman (ρ). La correzione per test multipli è stata eseguita utilizzando il metodo FDR di Benjamini-Hochberg, quando applicabile. I dati sperimentali sono stati espressi come media ± SD e sono stati confrontati utilizzando un test t di Student non appaiato a due code t test. Le analisi statistiche sperimentali sono state eseguite utilizzando un software di analisi statistica (versione 9.0).

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Risultati

GSE99671 ha identificato 105 geni differenzialmente espressi associati alla senescenza in CellAge
GSE99671 includeva 36 campioni provenienti da 18 tessuti appaiati. Dopo il filtraggio dei conteggi bassi, sono stati mantenuti 16.683 geni. Con un valore di P corretto < 0,05, 2.248 geni risultavano differenzialmente espressi. Applicando la soglia più rigorosa di P corretto < 0,05 e |log2FC| ≥ 1, 594 geni risultavano significativi, inclusi 102 geni upregolati e 492 geni downregola...

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Discussione

Questo studio ha identificato PPARG come gene prognostico candidato associato alla senescenza nell'osteosarcoma, integrando un'analisi dell'espressione differenziale, l'intersezione con i geni di CellAge, la modellizzazione della sopravvivenza in TARGET-OS, l'aggiustamento clinico, la localizzazione multi-omica e la validazione sperimentale. Questo schema analitico è coerente con l'attuale enfasi sulla ricerca sull'osteosarcoma informata a livello molecolare e sulle risorse curate di geni legati alla senescenza per l'int...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

CONTRIBUTI DEGLI AUTORI:
Yongwen Li e Wentao Qin hanno concepito e progettato lo studio. Yongwen Li ha eseguito le analisi bioinformatiche e computazionali. Tuo Liang ha eseguito la validazione sperimentale. Rubiao Qiu e Zide Zhang hanno contribuito alla preparazione delle figure. Rubiao Qiu e Zide Zhang hanno supervisionato lo studio e rivisto criticamente il manoscritto. Tutti gli autori hanno esaminato e approvato il manoscritto finale

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano con gratitudine i ricercatori e i collaboratori dei progetti GEO, TARGET-OS, UCSC Xena, CellAge, MSigDB e dell'atlante trascrittomico singola-cellula e spaziale del sarcoma osteogenico umano per aver reso disponibili pubblicamente set di dati e risorse che hanno permesso questo studio. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Guangxi Natural Science Foundation (No. 2023GXNSFAA026111).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpo primario anti-GAPDHProteintech Group, Wuhan, China10494-1-APAnticorpo primario utilizzato per rilevare GAPDH come controllo di caricamento nel western blot; diluizione 1:5.000.
Anticorpo primario anti-PPARGProteintech Group, Wuhan, China16643-1-APAnticorpo primario utilizzato per il rilevamento della proteina PPARG mediante western blot; diluizione 1:1.000.
Kit per saggio proteico BCABeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaPC0020Saggio colorimetrico utilizzato per determinare la concentrazione totale di proteine prima dell'elettroforesi.
DESeq2BioconductorVersione 1.40.2Pacchetto R utilizzato per l'analisi differenziale dell'espressione genica di dati trascrittomici basati su conteggi.
Mezzo Dulbecco modificato di Eagle (DMEM)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China11995Mezzo basale di coltura utilizzato per il mantenimento delle cellule di osteosarcoma 143B.
Reagente di rivelazione ECLBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaPE0010Substrato chemiluminescente utilizzato per il rilevamento di anticorpi coniugati con perossidasi di rafano nel western blot.
Siero bovino fetale (FBS)Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd. (Sijiqing), Huzhou, Zhejiang, China11011-8611Integratore sierico aggiunto al mezzo di coltura per sostenere la crescita e la vitalità cellulare.
glmnetCRANVersione 4.1-8Pacchetto R utilizzato per analisi di regressione penalizzata, inclusi modelli LASSO e rete elastica.
GraphPad PrismGraphPad Software, San Diego, CA, USAVersione 9.0Software utilizzato per l'analisi statistica, la generazione di grafici e la visualizzazione dei dati sperimentali.
Anticorpo secondario coniugato con HRPProteintech Group, Wuhan, ChinaSA00001-2Anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano utilizzato per il rilevamento nel western blot; diluizione 1:5.000.
Cellule di osteoblasti umaniCell Applications, Inc., San Diego, CA, USA406-05ACellule primarie di osteoblasti umani utilizzate come tipo cellulare di controllo non maligno.
Linea cellulare di osteosarcoma umano 143BAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USACRL-8303Linea cellulare di osteosarcoma umano utilizzata per esperimenti di validazione in vitro e saggi molecolari.
ImageJNational Institutes of Health (NIH), USAVersione 1.53Software di analisi delle immagini utilizzato per l'analisi quantitativa delle immagini sperimentali.
limmaBioconductorVersione 3.56.2Pacchetto R utilizzato per l'analisi dell'espressione differenziale e test statistici basati su modelli lineari.
Penicillina-streptomicinaBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaP1400Integratore antibiotico utilizzato nel mezzo di coltura cellulare per ridurre la contaminazione batterica.
Primer per PPARG e GAPDHSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai, ChinaSintesi su misura; le sequenze sono fornite nei MetodiPrimer oligonucleotidici su misura utilizzati per l'analisi qPCR dell'espressione di PPARG e GAPDH.
Membrane in PVDF, 0.45 µmBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaYA1701Membrane utilizzate per il trasferimento proteico durante il western blot.
Software statistico RR Foundation for Statistical Computing, Vienna, AustriaVersione 4.3.2Ambiente di calcolo statistico utilizzato per analisi bioinformatiche, costruzione di modelli e visualizzazione.
randomForestSRCCRANVersione 3.2.2Pacchetto R utilizzato per la modellizzazione con foreste casuali di sopravvivenza e analisi dell'importanza delle caratteristiche.
Kit di trascrizione inversaBeyotime Biotech Inc., Shanghai, ChinaD7168MUtilizzato per la sintesi del DNA complementare (cDNA) a partire da RNA isolato prima della PCR quantitativa.
Tampone di lisi RIPABeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaR0010Tampone per l'estrazione delle proteine utilizzato per lisare le cellule per l'analisi mediante western blot.
SeuratSatija LaboratoryVersione 5.0.1Pacchetto R utilizzato per l'elaborazione, l'integrazione, il clustering e la visualizzazione dei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula.
survivalCRANVersione 3.5-7Pacchetto R utilizzato per l'analisi della sopravvivenza, inclusa la modellizzazione dei rischi proporzionali di Cox.
Mix master qPCR con SYBR GreenBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaSR1110Mix fluorescente master utilizzato per l'amplificazione PCR quantitativa in tempo reale.
timeROCCRANVersione 0.4Pacchetto R utilizzato per generare curve ROC dipendenti dal tempo e calcolare le prestazioni predittive nel tempo.
Reagente TRIzolInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15596026CNReagente utilizzato per l'estrazione di RNA totale da cellule in coltura.
Tripsina-EDTA, 0,25%Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaT1300Reagente di dissociazione cellulare utilizzato per il passaggio e il raccolto di cellule aderenti.

Riferimenti

  1. Mirabello L, Troisi RJ, Savage SA. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 2009;115:1531-1543.
  2. Bielack SS, et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. J Clin Oncol. 2002;20:776-790.
  3. Isakoff MS, Bielack SS, Meltzer P, Gorlick R. Osteosarcoma: Current Treatment and a Collaborative Pathway to Success. J Clin Oncol. 2015;33:3029-3035.
  4. Kansara M, Teng MW, Smyth MJ, Thomas DM. Translational biology of osteosarcoma. Nat Rev Cancer. 2014;14:722-735.
  5. Peng P, et al. Epigenetic remodeling under oxidative stress: Mechanisms driving tumor metastasis. MedComm - Oncology. 2024;3.
  6. Muñoz-Espín D, Serrano M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:482-496.
  7. Coppé JP, Desprez PY, Krtolica A, Campisi J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 2010;5:99-118.
  8. Collado M, Serrano M. Senescence in tumours: evidence from mice and humans. Nat Rev Cancer. 2010;10:51-57.
  9. Lehrke M, Lazar MA. The many faces of PPARgamma. Cell. 2005;123:993-999.
  10. Peters JM, Shah YM, Gonzalez FJ. The role of peroxisome proliferator-activated receptors in carcinogenesis and chemoprevention. Nat Rev Cancer. 2012;12:181-195.
  11. Barrett T, et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 2013;41.
  12. Ho XD, et al. Whole transcriptome analysis identifies differentially regulated networks between osteosarcoma and normal bone samples. Exp Biol Med (Maywood). 2017;242:1802-1811.
  13. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15:550.
  14. Avelar RA, et al. A multidimensional systems biology analysis of cellular senescence in aging and disease. Genome Biol. 2020;21:91.
  15. Goldman MJ, et al. Visualizing and interpreting cancer genomics data via the Xena platform. Nat Biotechnol. 2020;38:675-678.
  16. Prentice RL, Zhao S. Regression Models and Multivariate Life Tables. J Am Stat Assoc. 2021;116:1330-1345.
  17. Heagerty PJ, Lumley T, Pepe MS. Time-dependent ROC curves for censored survival data and a diagnostic marker. Biometrics. 2000;56:337-344.
  18. Tibshirani R. The lasso method for variable selection in the Cox model. Stat Med. 1997;16:385-395.
  19. Jaeger BC, et al. OBLIQUE RANDOM SURVIVAL FORESTS. Ann Appl Stat. 2019;13:1847-1883.
  20. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:15545-15550.
  21. Newman AM, et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat Methods. 2015;12:453-457.
  22. Zhou Y, et al. Single-cell RNA landscape of intratumoral heterogeneity and immunosuppressive microenvironment in advanced osteosarcoma. Nat Commun. 2020;11:6322.
  23. Stuart T, et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 2019;177:1888-1902.e21.
  24. Hao Y, et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 2021;184:3573-3587.e29.
  25. Zheng X, et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human osteosarcomas. J Hematol Oncol. 2024;17:71.
  26. Ståhl PL, et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 2016;353:78-82.
  27. Kresse SH, et al. Integrative analysis reveals relationships of genetic and epigenetic alterations in osteosarcoma. PLoS One. 2012;7.
  28. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43.
  29. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25:402-408.
  30. Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 2012;9:671-675.
  31. Gill J, Gorlick R. Advancing therapy for osteosarcoma. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18:609-624.
  32. Sun L, et al. Single-cell RNA sequencing revealed PPARG promoted osteosarcoma progression: based on osteoclast proliferation. Front Immunol. 2024;15:1506225.
  33. Yuan B, et al. Nuclear receptor modulators inhibit osteosarcoma cell proliferation and tumour growth by regulating the mTOR signaling pathway. Cell Death Dis. 2023;14:51.
  34. Lu Y, et al. Oridonin exerts anticancer effect on osteosarcoma by activating PPAR-γ and inhibiting Nrf2 pathway. Cell Death Dis. 2018;9:15.
  35. Gorgoulis V, et al. Cellular Senescence: Defining a Path Forward. Cell. 2019;179:813-827.
  36. Faget DV, Ren Q, Stewart SA. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nat Rev Cancer. 2019;19:439-453.
  37. Hernandez-Segura A, et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Curr Biol. 2017;27:2652-2660.e4.
  38. Tian H, et al. Managing the immune microenvironment of osteosarcoma: the outlook for osteosarcoma treatment. Bone Res. 2023;11:11.
  39. Hanahan D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 2022;12:31-46.
  40. Ricote M, Li AC, Willson TM, Kelly CJ, Glass CK. The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of macrophage activation. Nature. 1998;391:79-82.
  41. Jiang C, Ting AT, Seed B. PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines. Nature. 1998;391:82-86.
  42. McShane LM, et al. REporting recommendations for tumour MARKer prognostic studies (REMARK). Br J Cancer. 2005;93:387-391.
  43. Moses L, Pachter L. Publisher Correction: Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 2022;19:628.

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