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</ol>

<table><tbody><tr><td>Reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>Reazioni PCR (Tavole 1, 3)</td></tr><tr><td>10X PBS, pH 7.4</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>Buffer base per colorazione (Passaggi 3.2&ndash;3.3)</td></tr><tr><td>5X Q5 Reaction Buffer</td><td>NEB</td><td>B9027S</td><td>Venduto separatamente; incluso anche con la polimerasi Q5</td></tr><tr><td>Agar, Bacto</td><td>BD Difco</td><td>281230-500g</td><td>Piatti di agar SDCAA (Tabella 5); 15 g/L</td></tr><tr><td>Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Elettroforesi su gel</td></tr><tr><td>Anti-FLAG PE Antibody</td><td>BioLegend</td><td>637309</td><td>Colorazione FACS; anti-FLAG PE-coniugata</td></tr><tr><td>Anti-HA Tag Antibody [FITC]</td><td>GenScript</td><td>A01621</td><td>Colorazione FACS; anti-HA FITC-coniugata</td></tr><tr><td>Bacto Casamino Acids</td><td>BD Difco</td><td>223120</td><td>Media SDCAA+, SGCAA+, SCAA (Tabella 5); 5 g/L</td></tr><tr><td>Bacto Peptone / Tryptone</td><td>RPI</td><td>T60060-10000.0</td><td>Preparazione media LB/SOB; 20 g/L in YPD (Tabella 5)</td></tr><tr><td>BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126575-10GM</td><td>0,5% in PBS; buffer di colorazione (Passaggi 3.2&ndash;3.3)</td></tr><tr><td>BsmBI-v2 (200 U)</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td>Montaggio Golden Gate del soggetto cassette (Tabella 8)</td></tr><tr><td>Calcium chloride solution (1M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100mL</td><td>Buffer per elettroporazione: 1 mM finale (Tabella 5)</td></tr><tr><td>ColiRollers&reg; Plating Beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71013-3</td><td>Sterilizzare mettendo in bottiglie di reagenti e autoclavare a 121&ordm;C, 15 psi, per 15 minuti.</td></tr><tr><td>D-Galattosio</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12813.30</td><td>250 g; 20% w/v stock per induzione SGCAA+ (Tabella 5)</td></tr><tr><td>D-Sorbitolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>1327300.10</td><td>Buffer per elettroporazione (1 M) e media di crescita (Tabella 5)</td></tr><tr><td>Dextrosio (D-Glucosio), anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>YPD, SDCAA+, 20% w/v destrosio stock (Tabella 5)</td></tr><tr><td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td><td>Sigma</td><td>Y0626-250G</td><td>6,7 g/L in SDCAA/SGCAA (Tabella 5)</td></tr><tr><td>Difco YPD Broth (pre-misto)</td><td>BD</td><td>242820-500g</td><td>YPD pre-confezionato alternativo; 500 g</td></tr><tr><td>DL-Dititreitolo (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Buffer di condizionamento: 10 mM finale; aliquotare 250 &mu;L, conservare &minus;20&deg;C</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6492-02</td><td>Pulizia del prodotto PCR</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Gel Extraction Kit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D2500-01</td><td>Purificazione del gel post-PCR e digestione con restrizione (Passaggi 1.1.8, 1.3.2)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6942-02</td><td>Purificazione del plasmide (Passaggio 4.2)</td></tr><tr><td>Glicerina (&ge;99%)</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td>Stock al 50% v/v per stock in glicerolo (Passaggio 4.1.1)</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>SDCAA+ e SGCAA+: 50 &mu;g/mL finale; sostituisce Sigma K0879-5G</td></tr><tr><td>KLD Enzyme Mix</td><td>NEB</td><td>M0554S</td><td>Kinase-Ligase-DpnI; mutagenesi diretta dal sito</td></tr><tr><td>KLD Reaction Buffer</td><td>NEB</td><td>B0554A</td><td>Usato con KLD Enzyme Mix</td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td>Coltura liquida E. coli</td></tr><tr><td>Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc&middot;2H2O)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A17921.30</td><td>Buffer di condizionamento: 0,1 M finale; aggiungere prima del DTT (Tabella 5)</td></tr><tr><td>Luria Agar (Luria-Bertani Agar)</td><td>RPI</td><td>L24020-2000.0</td><td>Piatti di E. coli; sostituisce Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG</td></tr><tr><td>OmniPur Casamino Acids</td><td>Sigma</td><td>2240-500GM</td><td>Alternativa casamino acidi</td></tr><tr><td>pDD1523</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP</td></tr><tr><td>pDD1524</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>SDCAA+, SGCAA+: 1X finale</td></tr><tr><td>PstI-HF (5000 U)</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td>Linearizzazione del vettore (Tabella 10); utilizzare la versione HF</td></tr><tr><td>Q5 HF DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Polimerasi ad alta fedeltà; alternativa a Q5 Hot Start</td></tr><tr><td>Q5 High GC Enhancer</td><td>NEB</td><td>B9028A</td><td>Per reazioni PCR ad alto contenuto GC</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Montaggio e amplificazione PCR (Tavole 1, 3)</td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer (10X)</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Fornito con PstI-HF e SphI-HF (Tabella 10)</td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>NEB</td><td>R3138L</td><td>Enzima di restrizione aggiuntivo</td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td>Recupero post-trasformazione</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>Preparazione media LB / SOB</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td>Aggiustamento del pH

flusso di lavoro ottimizzato per la visualizzazione delle superfici del lievito per l'evoluzione diretta delle proteasi

Optimized Yeast Surface Display Workflow for Directed Evolution of Proteases

Flusso di lavoro ottimizzato per la visualizzazione delle superfici del lievito per l'evoluzione diretta delle proteasi

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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