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</ol>

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>PCR反応（表1、3）</td></tr><tr><td>10X PBS、pH 7.4</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>染色バッファーベース（ステップ3.2&ndash;3.3）</td></tr><tr><td>5X Q5 Reaction Buffer</td><td>NEB</td><td>B9027S</td><td>別売り；Q5ポリメラーゼに付属</td></tr><tr><td>Agar、Bacto</td><td>BD Difco</td><td>281230-500g</td><td>SDCAAアガープレート（表5）；15 g/L</td></tr><tr><td>Agarose（Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade）</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>Anti-FLAG PE Antibody</td><td>BioLegend</td><td>637309</td><td>FACS染色；PE結合抗FLAG</td></tr><tr><td>Anti-HA Tag Antibody [FITC]</td><td>GenScript</td><td>A01621</td><td>FACS染色；FITC結合抗HA</td></tr><tr><td>Bacto Casamino Acids</td><td>BD Difco</td><td>223120</td><td>SDCAA+、SGCAA+、SCAA培地（表5）；5 g/L</td></tr><tr><td>Bacto Peptone / Tryptone</td><td>RPI</td><td>T60060-10000.0</td><td>LB/SOB培地調製；YPD（表5）で20 g/L</td></tr><tr><td>BSA、Bovine Serum Albumin、Fraction V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126575-10GM</td><td>0.5% PBS中；染色バッファー（ステップ3.2&ndash;3.3）</td></tr><tr><td>BsmBI-v2（200 U）</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td>Golden Gate組立の基質カセット（表8）</td></tr><tr><td>Calcium chloride solution（1M）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100mL</td><td>電気ポアレーションバッファー：最終1 mM（表5）</td></tr><tr><td>ColiRollers® Plating Beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71013-3</td><td>試薬ボトルに入れ、121℃、15 psiで15分間オートクレーブして滅菌する。</td></tr><tr><td>D-Galactose</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12813.30</td><td>250 g；SGCAA+誘導用20% w/v ストック（表5）</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Thermo Fisher</td><td>1327300.10</td><td>電気ポアレーションバッファー（1 M）と成長培地（表5）</td></tr><tr><td>Dextrose（D-Glucose）、無水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>YPD、SDCAA+、20% w/v デキストローストック（表5）</td></tr><tr><td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td><td>Sigma</td><td>Y0626-250G</td><td>SDCAA/SGCAA（表5）で6.7 g/L</td></tr><tr><td>Difco YPD Broth（pre-mixed）</td><td>BD</td><td>242820-500g</td><td>YPDの代替品；500 g</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol（DTT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>調整バッファー：最終10 mM；250 μLずつ分液、-20℃で保存</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6492-02</td><td>PCR製品の精製</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Gel Extraction Kit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D2500-01</td><td>PCRおよび制限酵素消化後のゲル精製（ステップ1.1.8、1.3.2）</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6942-02</td><td>プラスミド精製（ステップ4.2）</td></tr><tr><td>Glycerol（≥99%）</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td>グリセロールストック用50% v/v ストック（ステップ4.1.1）</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>SDCAA+およびSGCAA+：最終50 μg/mL；Sigma K0879-5Gの代替</td></tr><tr><td>KLD Enzyme Mix</td><td>NEB</td><td>M0554S</td><td>Kinase-Ligase-DpnI；重点突然変異</td></tr><tr><td>KLD Reaction Buffer</td><td>NEB</td><td>B0554A</td><td>KLD酵素ミックスと併用</td></tr><tr><td>LB Broth（Lennox）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td>E. coli液体培養</td></tr><tr><td>Lithium Acetate Dihydrate（LiOAc・2H2O）</td><td>Thermo Fisher</td><td>A17921.30</td><td>調整バッファー：最終0.1 M；DTTの前に加え（表5）</td></tr><tr><td>Luria Agar（Luria-Bertani Agar）</td><td>RPI</td><td>L24020-2000.0</td><td>E. coliのプレート培養；Sigma LB Agar Lennox L2897-1KGの代替</td></tr><tr><td>OmniPur Casamino Acids</td><td>Sigma</td><td>2240-500GM</td><td>代替のカサミノ酸源</td></tr><tr><td>pDD1523</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI；Gal1-Aga2-sfGFP</td></tr><tr><td>pDD1524</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution、100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>SDCAA+、SGCAA+：最終1X</td></tr><tr><td>PstI-HF（5000 U）</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td>ベクター線形化（表10）；HFバージョンを使用</td></tr><tr><td>Q5 HF DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>高忠実度ポリメラーゼ；Q5 Hot Startの代替</td></tr><tr><td>Q5 High GC Enhancer</td><td>NEB</td><td>B9028A</td><td>高GC含有量PCR反応用</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>PCR組立と増幅（表1、3）</td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer（10X）</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>PstI-HFおよびSphI-HF（表10）に付属</td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>NEB</td><td>R3138L</td><td>追加の制限酵素</td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td>形質転換後の回復</td></tr><tr><td>Sodium Chloride（NaCl）</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>LB/SOB培地調製</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide（NaOH）</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td>培地のpH調整</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic（Na2HPO4）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-500G</td><td>SDCAAプレート、SCAA培地：38 mM（表5）</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic、無水</td><td>VWR（BDH）</td><td>BDH

プロテアーゼの指向性進化のための最適化された酵母表面表示ワークフロー

Optimized Yeast Surface Display Workflow for Directed Evolution of Proteases

Directed evolution mimics the natural evolutionary process in a fast, controlled laboratory environment to evolve proteins with desirable functions or ...

optimized-yeast-surface-display-workflow-for-directed-evolution

Research

JoVE Journal

Bioengineering

私たちは、Saccharomyces cerevisiaeの指向性進化キャンペーンのための突然変異体ライブラリを構築し、スクリーニングするための詳細なプロトコルを提示します。...

指向進化方法で<em&gt;サッカロマイセス・セレビシエ</em&gt;：変異体ライブラリーの作成およびスクリーニング

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このプロトコールは、目的の抗原に結合するタンパク質変異体を濃縮するための酵母表面ディスプレイ選択キャンペーンを実施するための重要なステップを説明しています。...

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ここでは、酵母表面表示基質を酵素修飾アッセイに使用するためのプロトコールを紹介します。このプラットフォームは、代表的な酵素修飾アッセイとして、チロシンホスファターゼSHP-2の基質の1つに対する脱リン酸化活性の分析を使用して実証されました。...

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汎用性の高いプラズマのリソグラフィ技術は、細胞付着を導くための安定した表面のパターンを生成するために開発されました。この手法は、自然の組織を模倣する、いくつかの、異なる細胞タイプを研究するために使用されているものを含め、携帯ネットワークを作成するために適用することができます。...

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このプロトコルは、細胞を追跡することができますカスタム設計electrotactic室で2Dと3D環境を確立するために使用されるメソッドを示しています...

2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

オンチップ光重合技術を用いた高分子マイクロアレイの形成の説明。原子間力顕微鏡、水接触角の測定値を使用して高スループット表面特性、飛行二次イオン質量分析法と細胞接着アッセイのX線光電子分光法と時間も記載されている。...

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ここではそれらの完全な複製および/または時系列の寿命の間に単一の出芽酵母細胞の連続的かつ高分解能顕微鏡イメージングを可能にするマイクロ流体装置の動作を説明する。...

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生体適合性のpH応答性ゾル - ゲルナノセンサーは、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場に組み込むことができる。産自己申告足場は、足場上に細胞を培養しながら微小環境条件の現場モニタリングのために使用することができる。 3D構築物が細胞の実験を妨害することなく、リアルタイムでモニターすることができるので、これは有益である。...

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生理フローの状況の下で循環細胞のケモカイン指向溢出を研究する新規三次元フローチャンバーデバイス

The University of Texas at Dallas.  このプロトコルは、表面ディスプレイベースの選択システムを用いて 、サッカロマイセス・セレビシア エにおけるウイルスプロテアーゼの指向性進化に最適化されたワークフローを提供します。DNAインサートライブラリおよび基板カセット設計、高い形質効率に最適化された電気穿孔、蛍光活性化細胞選別によるプロテ?...

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