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저자들은 청두 중의약 대학교 학교 재단의 지원에 감사드립니다. 또한, MPRC2022034 연구비 지원에 감사드립니다. 본 연구비는 단순 비만 마우스의 치료를 위한 이진탕(Erchen Decoction) 내 장내 세균의 3D 동적 이미징 방법을 개발하는 데 사용되었습니다. 저자들은 청두 중의약 대학교 중의약 및 약학 혁신 연구소와 학제 간 연구소에서 제공한 연구 플랫폼에 감사를 표합니다.

본 프로토콜은 상용 세포주(HT22, ATCC)를 사용하며, 인간 피험자나 일차 인간 조직을 포함하지 않습니다. 본 연구에는 동물이 사용되지 않았습니다.
1. 표준화된 시료 준비
<ol>
	<li>HT22 세포 준비
	<ol>
		<li>HT22 세포의 합류도(confluence)가 80%에 도달하면10,11, 기존 배지를 제거한다. 0.25% trypsin을 사용하여 세포를 떼어내고, 실온에서 1–2분 동안 배양한다.</li>
		<li>0.25% trypsin 부피의 3배에 해당하는 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)을 첨가하여 세포 분리를 중단시킨다. 세포 현탁액을 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.</li>
		<li>실온에서 175 x g로 3분간 원심분리한 후 상층액을 제거한다. 완전 DMEM에 세포를 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 만든다.</li>
		<li>세포 계수기를 사용하여 세포 수를 측정한다. 96-well plate의 웰당 100 µL의 완전 배지에 5,000개의 세포를 분주한다12.</li>
		<li>플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양한다. 실험 설계에 따라 96-well plate에서 시료 그룹화, 투여 및 염색 작업을 수행한다. 
		&#8203;참고: 이미징 시스템과 호환되는 96-well plate를 사용한다. 제조사 사양에 따라 적절한 바닥 두께와 기하학적 구조를 가진 플레이트를 선택한다. 더 높은 이미지 품질이 필요한 경우에는 글라스 바닥 플레이트(바닥 두께 130–170 µm)를 권장한다13,14,15,16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>염색 과정
	<ol>
		<li>세포 중첩을 최소화하기 위해 세포가 단일층으로 잘 분산되어 형성되었는지 확인하고, 합류도가 70%를 초과하지 않도록 한다(그림 1B).</li>
		<li>실험 요구 사항에 따라 시료를 그룹화하고 처리 후 염색을 진행한다. PI의 최종 농도는 6.684 µg/mL, Hoechst 33342의 최종 농도는 10 µg/mL가 되도록 염료 작동 용액을 준비한다17,18.</li>
		<li>96-well plate에서 기존 배지를 제거하고 각 웰을 100 µL의 PBS로 2회 세척한다. 염료 작동 용액을 첨가하고 염색을 위해 암실의 실온에서 30분 동안 배양한다.</li>
		<li>각 웰을 100 µL의 PBS로 2회 세척한 후 DMEM을 첨가한다. 
		참고: 실험 설계에 따라 시료 로딩 및 염색 파라미터가 다를 수 있다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 이미징 사양 및 파라미터 설정
<ol>
	<li>이미징 파라미터 표준 
	&#8203;참고: 본 연구는 PI 및 Hoechst 33342 염색 후 장비의 와이드필드(widefield) 이미징 워크플로우만을 보여줍니다.
	<ol>
		<li>장비의 전원을 켜고 컴퓨터를 시작합니다. 장치와 함께 제공된 분석 소프트웨어를 엽니다.</li>
		<li>96-웰 플레이트를 장비에 로드합니다. 이미징을 위해 샘플이 포함된 시야(field of view)를 선택합니다.</li>
		<li>Objective 및 Camera 설정에서 배율(Magnification)을 &#34;20XPh1SPlanFluorELWDADM&#34; (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230)로, Camera binning을 &#34;2&#34;로, Acquisition Mode를 &#34;Widefield&#34;로 설정합니다.</li>
		<li>플레이트 모드에서 96-웰 플레이트의 해당 파라미터를 선택하고 제품 크기 데이터에 따라 플레이트 파라미터를 조정합니다.</li>
		<li>Site Option에서 고밀도 이미징을 위해 일반적으로 웰당 9개 필드를 선택합니다. Autofocus 옵션에서 Enable laser-based focusing을 선택합니다.</li>
		<li>최소 3개의 샘플 웰에서 측정한 평균 플레이트 바닥 두께를 기준으로 Autofocus의 레이저 오토포커스 파라미터를 조정합니다. Bottom thickness, Bottom thickness max variation, Adjacent well max variation, Intra-well max variation 및 Plate max variation을 그에 맞게 조정합니다.</li>
		<li>Wavelengths에서 파장 수(Number of wavelengths)를 3으로 설정합니다. 첫 번째 Illumination으로 DAPI를 선택합니다. Shading Correction에서 &#34;Auto Correction for FL&#34;을 선택합니다 (그림 2B).</li>
		<li>이미지를 찾은 후, 초기 노출 시간(Exposure (ms))을 20–30으로 설정합니다. 캡처된 이미지를 관찰하고 과노출 없이 적절한 형광 강도를 얻을 때까지 노출을 지속적으로 조정하며, 비트 깊이(bit depth)를 16으로 설정합니다 (그림 2A).</li>
		<li>초점 조정을 위해 z-offset이 포함된 Laser를 선택합니다. 초점이 명확하지 않은 경우 Use Z stack을 체크하고 Calculate Offset을 클릭한 후 적절한 초점 거리를 선택합니다. Digital Confocal (info)를 체크하고 Increase Sharpness 및 Reduce Noise의 조정 파라미터를 0.200으로 설정합니다. 
		참고: 이미지 노출이나 선명도가 만족스럽지 않은 경우, 노출을 조정하고 오프셋 파라미터를 다시 계산하십시오.</li>
		<li>두 번째 Illumination으로 Cy3를 선택합니다. 단계 2.1.7-2.1.9와 동일한 설정을 따릅니다.</li>
		<li>세 번째 Illumination으로 TL 25를 선택합니다. 단계 2.1.7-2.1.9와 동일한 설정을 따릅니다. 
		참고: 채널에 따라 Shading correction을 설정하며, TL 25는 Auto Correction for TL을 선택해야 합니다. Wavelengths에서 TL 채널은 세포 위치 지정 및 형태학적 관찰을 위해 설정해야 합니다.</li>
		<li>Run 탭에서 플레이트 이름을 명명 규칙(플레이트 이름-세포 유형-실험 ID-날짜-대물렌즈 배율-이미징 유형)에 따라 지정합니다. Description에서 이미징 채널 관련 파라미터를 확인합니다.</li>
		<li>Acquire Plate를 클릭하여 이미징을 시작합니다. 이미징이 완료되면 소프트웨어, 장비, 컴퓨터 순으로 종료합니다. 
		&#8203;참고: 이후 컴퓨터는 이미지 내보내기, 데이터 처리 및 결과 분석을 위해서만 켤 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>이미징 작동 표준 및 요구 사항
	<ol>
		<li>에지 효과(edge effects)를 피하기 위해 시야를 웰의 중앙에 맞춥니다 (그림 1A). 이미징 파라미터 설정 시, 형광 강도가 가장 높은 양성 대조군을 기준으로 사용합니다. 또한, 초점을 맞출 때 잔해물이 없고 깨끗하며 세포가 단층으로 이루어진 시야를 선택합니다.</li>
		<li>카메라의 경우, 정보의 영구적인 손실을 초래할 수 있는 포화를 방지하기 위해 픽셀 값을 60000 미만(최댓값 65535)으로 엄격히 제어합니다. 포화된 밝은 점이나 영역이 나타나면 노출 시간을 단축합니다. 동시에 노출 시간을 너무 낮게 유지하지 마십시오. 그렇지 않으면 노이즈가 이미지의 주가 됩니다.</li>
		<li>약한 형광 신호의 경우, 광퇴색(photobleaching)으로 인한 가역 불가능한 손상을 피하기 위해 파라미터를 강제로 높이기보다는 노출 시간을 약간 늘리는 것을 우선시합니다. 
		참고: 명시야 이미징의 경우 이러한 원칙을 적절히 완화할 수 있으나, 핵심 초점은 신호 무결성과 샘플 보호에 있습니다.</li>
		<li>샘플의 에지 윤곽이 명확하게 구별되는지 확인하고, 내부 미세 구조(과립, 섬유, 세포소기관 등)가 흐릿하지 않고 뚜렷한 질감을 가지며, 배경 산란광이 국부적인 밝은 점이나 흐릿한 헤일로 없이 균일하게 분포되었는지 확인합니다. 과초점(over-focusing) 및 저초점(under-focusing)을 엄격히 피하십시오.</li>
		<li>정상, 양성, 음성 및 실험군이 모두 포함되어 있는지 확인하고, 각 처리군당 최소 3개의 병렬 웰을 확보하십시오. 병렬 웰은 수직으로 배치하는 것을 권장합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 이미지 처리 및 분석
참고: 본 문서는 기기 전용 소프트웨어에서 제공하는 세 가지 이미지 처리 방법을 설명하며, 이 방법들은 모두 본 연구에 사용된 염색 프로토콜에 적합합니다. 이러한 방법들은 인식이라는 동일한 기본 원리를 공유하지만, 세부적인 처리 기술과 데이터 결과의 유형에서는 차이가 있습니다. 이미지 처리 워크플로우는 다음과 같이 동일하게 진행되었습니다: 파일 열기 → 해당 처리 방법으로 원본 이미지 로드 → 적절한 채널 파라미터 설정 → 마스크(Mask) 생성 → Measure에서 측정 데이터 유형 설정 → 분석 실행 → 결과 관찰 → 데이터 내보내기.
<ol>
	<li>장치와 함께 제공된 분석 소프트웨어를 엽니다 → Review Plate → Select Plate를 선택합니다.</li>
	<li>Date 보기에서 Well arrangement를 선택하고 양성 군의 시야(field of view) 중 하나를 참조로 선택합니다.</li>
	<li>Run Analysis 항목에서 해당 처리 프로그램을 선택하고 이미지 처리 파라미터를 설정하거나 이미지를 내보냅니다.</li>
	<li>파라미터를 설정하고 저장한 후, 파라미터 설정 대상에 따라 Run on all wells/ Run on selections/ Run on displayed site를 선택합니다.</li>
	<li>컴퓨터가 데이터 처리를 완료하면, Measurements 탭의 Analysis에서 해당 데이터 처리 프로그램을 선택하고 Measurement에서 서로 다른 측정 결과를 선택하여 데이터를 확인합니다.</li>
	<li>Open Log를 클릭하여 데이터 내보내기를 시작합니다. 세 가지 이미지 처리 방법에 대한 파라미터 설정에서 다음 세부 사항을 설정합니다:
	<ol>
		<li>이미지 처리 방법 1: Multi-Wavelength Cell Scoring
		<ol>
			<li>Multi-Wavelength Cell Scoring 프로그램을 선택하고 설정을 구성합니다. Number of wavelengths를 설정합니다. Algorithm은 Standard를 선택합니다.</li>
			<li>PI 염색 결과를 바탕으로 모든 핵에 대한 인식 파라미터를 설정합니다. 기본 W1 Source 이미지는 DAPI 채널입니다.</li>
			<li>인식할 개별 객체의 크기에 따라 Approximate min width를 8–10 µm로, Approximate max width를 30–35 µm로 설정합니다.</li>
			<li>intensity above local background를 2,000–10,000 gray levels로 설정합니다. Preview를 사용하여 인식 결과에 따라 설정을 테스트하고 조정합니다.</li>
			<li>Hoechst 33342 염색 결과를 바탕으로 W2 파라미터를 설정합니다. 이 채널의 이름을 지정합니다. W2 Source 이미지는 Cy3입니다.</li>
			<li>Stained area에서 이 채널에 의해 염색된 영역을 Nucleus로 선택합니다. 이후 설정은 단계 3.6.1.3–3.6.1.4의 설정과 동일하게 따릅니다. Configure Summary Log 또는 Configure Data Log (Cells)에서 원하는 결과 파라미터에 따라 해당 Parameter configuration을 선택합니다. 
			참고: 일반적으로 Configure Summary Log는 필요한 데이터 유형을 설정하는 데 사용되며, Configure Data Log (Cells)는 개별 세포의 특수 마킹이 필요한 경우에 사용됩니다.</li>
			<li>Test Run을 수행하여 인식을 관찰합니다. 인식 결과가 만족스러우면 설정을 저장합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>이미지 처리 방법 2: Live-Dead
		<ol>
			<li>Live-Dead 프로그램을 선택하고 설정 구성을 시작합니다. Wavelength 1 Parameters와 Wavelength 2 Parameters를 순차적으로 설정합니다.</li>
			<li>Wavelength 1 Parameters에서 Wavelength 1 Source를 DAPI로 설정합니다. 기본 Algorithm은 &#34;Standard&#34;입니다.</li>
			<li>염색 조건에 따라 Stained cell type을 All Cells로, Stained area를 Nucleus로 설정합니다. Approximate min width, Approximate max width 및 intensity above local background는 Multi-Wavelength Cell Scoring 방법과 동일한 설정을 사용합니다.</li>
			<li>Split touching objects를 체크하고 Preview를 사용하여 테스트합니다.</li>
			<li>Wavelength 2 Parameters에서 Wavelength 2 Source를 Cy3로 설정합니다.</li>
			<li>특정 염색에 따라 Stained cell type을 Dead로, Stained area를 Nucleus로 설정합니다. Approximate min width, Approximate max width 및 intensity above local background는 Multi-Wavelength Cell Scoring 방법과 동일한 설정을 사용합니다.</li>
			<li>Configure Summary Log를 클릭하고 필요한 데이터 유형에 따라 Parameter configuration을 선택합니다. Test Run을 수행하여 인식을 관찰합니다. 인식 결과가 만족스러우면 설정을 저장합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>이미지 처리 방법 3: developer mode CME
		<ol>
			<li>Custom Module (CME) 프로그램을 선택하고 설정 구성을 시작합니다. Image Names와 채널을 설정합니다. 
			참고: 이후의 파라미터 설정을 용이하게 하기 위해 일반적으로 이미징 중에 사용된 채널 이름으로 설정합니다.</li>
			<li>Find Objects에서 Simple Threshold를 열어 전체 세트에 대한 인식을 설정합니다.</li>
			<li>Source가 Image Name과 일치하도록 설정합니다. 16-bit 그레이스케일 값 범위에 따라 Threshold Low에 0을, Threshold High에 65535를 입력합니다.</li>
			<li>Result에 처리 결과의 이름을 지정하고, 적용(apply)한 뒤 마킹 상태를 관찰합니다. Find Objects에서 Find Blobs를 열어 Mask 결과를 생성합니다.</li>
			<li>Simple Threshold에서와 같이 Source가 Image Name과 일치하도록 설정합니다. Approximate min width, Approximate max width 및 intensity above local background를 Multi-Wavelength Cell Scoring 설정에 따라 설정합니다.</li>
			<li>Result에 처리 결과의 이름을 지정하고, 적용한 뒤 마킹 결과를 관찰합니다. Find Blobs 인식 결과에 대해 Modify Objects 도구를 사용하여 필터링, 확장(grow), 축소(shrink) 및 반전(invert)을 수행합니다.</li>
			<li>Measure에서 Modified를 설정합니다. Measurement Inputs에서 Standard Area Value에 1을 입력하고 Create Object Overlay를 체크합니다.</li>
			<li>Objects to Measure에서 Mask of Objects의 마킹된 객체 소스와 Image to Measure의 측정 대상 소스 이미지를 선택합니다. 필요한 처리 결과 파라미터에 따라 해당 Measurement Name을 선택하고, 적용한 뒤 파라미터 인식 결과를 관찰합니다.</li>
			<li>파라미터 설정을 확인한 후 구성을 저장합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>일반 방법: ImageJ 
		&#8203;참고: 형광 이미지에 대해 ImageJ 방법19을 사용하여 이미징 결과를 분석한 다음, 본 장비의 세 가지 방법과 비교 분석을 수행합니다.
		<ol>
			<li>ImageJ 소프트웨어를 엽니다. 이미지 불러오기: File → Open → 분석할 원본 그레이스케일 이미지를 선택합니다.</li>
			<li>이미지를 8-bit로 변환합니다: Image → Type → 8-bit. 그레이스케일 값 인식: Image → Adjust → Threshold → Default, Red → Check Dark background → Set → OK. 
			참고: 빨간색 영역 인식이 만족스럽지 않은 경우, Default를 다른 16가지 내장 ImageJ 인식 모델 중 하나로 교체하거나 대화 상자의 슬라이더를 조정합니다.</li>
			<li>파라미터 설정: Analyze → Set Measurements. 팝업 대화 상자에서 Area, Mean gray value, Integrated density, Limit to threshold, Display label을 체크하고, Redirect to는 기본값인 None으로 둔 뒤, Decimal places (0-9)에 2를 입력합니다. OK를 클릭합니다.</li>
			<li>인식 결과 분석: Analyze → Measure. 결과 저장: 팝업 결과 대화 상자에서 File → Save As를 선택하고 저장 위치를 지정합니다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>이미지 내보내기
	<ol>
		<li>품질이 좋은 양성 well의 시야를 참조 표준으로 선택합니다. 
		참고: 기본 품질 요구 사항은 진실성, 정확한 초점, 적절한 노출(16-bit) 및 적절한 대비(신호 대 잡음비가 높을수록 좋음)입니다. 고품질 요구 사항에는 뚜렷한 특징, 대비, 실용성, 직관적인 형태 변화 및 핵심 포인트 강조 등이 포함됩니다.</li>
		<li>Run Analysis의 Analysis 섹션에서 ExportPro를 선택하고 Analysis를 위한 Run Setup을 시작합니다. Select output options에서 이미지 요구 사항에 따라 Individual channel, Color overlay, shrink image(선택 사항) 및 Scale bar(선택 사항)를 선택합니다.</li>
		<li>각 시야에서 내보낼 형광 채널 이미지를 선택합니다. Individual Channel에서 각 채널의 색상을 선택합니다(예: DAPI 채널은 Blue, TL 채널은 Monochrome).</li>
		<li>Color overlay에서 BRIGHTFIELD, RED, BLUE, GREEN에 해당하는 채널을 순서대로 선택합니다(컬러 오버레이를 위한 색상 파장을 선택함). Number를 100으로 설정하고, 프리뷰 이미지를 관찰한 후 프리뷰 결과를 수락합니다.</li>
		<li>output의 Export to folder에서 내보낸 이미지가 저장될 폴더를 선택합니다. 실행(run)을 시작합니다. 
		참고: 동일한 배치의 이미지를 개별적으로 내보내서는 안 됩니다. 여기서 한 배치의 이미지란 완전히 동일한 실험 조건에서 얻은 음성 대조군, 양성 대조군, 기본 대조군 및 대상 실험군의 4가지 핵심 샘플 이미지 모음을 의미합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>이미지 처리 방법 비교
	<ol>
		<li>9개의 시야를 선택하여 기존의 수동 사멸 및 생존 세포 계수 방식과 Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME, ImageJ 방법의 생존 세포, 사멸 세포 및 사멸/생존 세포 비율 계수 결과를 비교합니다. GraphPad Prism 버전 10.1을 사용하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA)과 Tukey의 다중 비교 테스트를 수행하여 차이를 분석합니다.</li>
		<li>81개의 시야를 선택하여 Multi-Wavelength Cell Scoring, Live-Dead, CME, ImageJ 방법 간의 세포 수, 면적 및 강도의 차이를 비교합니다. GraphPad Prism 버전 10.1을 사용하여 일원 분산 분석(one-way ANOVA)과 Tukey의 다중 비교 테스트를 수행하여 차이를 분석합니다. 
		참고: 세포 배양 및 염색 실험은 반드시 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 수행해야 합니다. 폐액, 팁 및 기타 실험 폐기물은 실험실 규정에 따라 폐기하십시오. 실험 전 과정 동안 충분한 보호 장구를 착용하십시오.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

모든 저자는 이해상충이 없음을 밝힙니다. 원고 번역 과정에서 Zhipu AI는 오직 번역 목적으로만 사용되었으며, 연구 데이터, 실험 결과 또는 핵심 학술 내용을 생성하는 데 사용되지 않았습니다. 저자들은 원고의 내용에 대해 모든 책임을 집니다.

PI 및 Hoechst 이중 염색법을 사용하여 세포 생존율을 결정하는 경우, 예를 들어 하이콘텐츠 분석 장비는 내장된 알고리즘 모듈을 통해 동일 배치 내의 세포 생존율을 신속하고 고속으로 계산할 수 있습니다. 이 방법은 적은 시료 양, 낮은 비용, 최소한의 세포 손상, 약한 형광 퇴색, 소광에 대한 저항성 및 다중 이미지 캡처 능력 등 여러 가지 장점이 있습니다. 또한, 96-well 플레이트의 이미징 시간은 일반적으로 30–45 min20에 불과합니다.
실험 프로토콜에서 이미징 품질을 보장하려면 다음 단계들에 집중하십시오. 첫째, 지나치게 높은 세포 밀도로 인해 이미지가 세포로 가득 차거나, 너무 낮은 밀도로 인해 염색 및 세척 과정에서 세포가 씻겨 내려가는 것을 방지하기 위해 적절한 플레이트 밀도를 확보하십시오. 둘째, 잔류 염료가 이미징에 영향을 미치지 않도록 염료를 철저히 세척하십시오. 부착력이 낮은 세포의 경우, 염색 전후로 액...

고함량 이미징 시스템(High-Content Imaging System)은 현대 과학 연구의 핵심 도구로서, 손상되었거나 손상되지 않은 세포의 고속 이미징 및 다중 파라미터 평가를 가능하게 합니다1,2,3. 이 시스템은 다양한 학문 분야에서 대체 불가능한 역할을 수행합니다. 생명과학 분야에서는 연구자가 세포와 조직의 미시 세계를 탐구하는 것을 돕습니다4,5. 예를 들어, 세포 내 형광 표지된 분자와 구조를 정밀하게 검출함으로써 세포의 미세 구조와 동적인 변화를 명확하게 시각화할 수 있습니다6. 신경과학 연구에서는 뉴런의 3차원 이미징을 수행하여 신경망의 복잡한 연결 및 신호 전달 기전 분석을 지원하며, 이는 뇌 기능과 신경계 질환의 발병 기전을 이해하는 데 중요한 단서를 제공합니다7,8,9.
High-Content Imaging System 기술의 상당한 장점에도 불구하고, 이미지 처리 과정에는 몇 가지 문제점이 남아 있습니다. 시료 준비 단계에서는 주관성이 매우 높게 나타납니다. 생물학적 시료 준비의 경우, 세포 처리 및 염색과 같은 과정에 관련 표준이 부족합니다. 이미지 파라미터 측면에서는 실험실과 high-content 현미경 모델에 따라 노출 시간과 웰 플레이트 선택에 뚜렷한 차이가 있습니다. 데이터 처리 단계에서는 원본 이미지의 노이즈 감소 및 대비 조정부터 파라미터 식별 및 표적 특징 결정에 이르기까지 표준화가 부족한 실정입니다. 이러한 문제들은 현미경 이미지 결과의 편향으로 직접적으로 이어져, 재현성의 위기를 초래합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 원심분리 튜브</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>MCT-001-150</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 피펫 팁</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>이 세션에서는 고분자 겔 기반의 생체 모방 플랫폼을 사용하여 하이드로겔 내의 3차원 세포 배양 환경을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 세포-기질 상호작용을 모방하여 생체 내 환경과 유사한 조건에서 세포의 거동과 기능을 연구하는 데 유용합니다.

준비물
- 고분자 전구체 (예: PEGDA, GelMA)
- 광개시제 (예: Irgacure 2959, LAP)
- 세포 현탁액
- UV 조사 장치 또는 가시광선 광원
- 몰드 또는 웰 플레이트
- 멸균된 파이펫 및 팁
- 세포 배양 배지

절차

1. 전구체 용액 준비
- 선택한 고분자 전구체를 적절한 농도로 증류수 또는 PBS에 용해합니다.
- 광개시제를 전구체 용액에 첨가하고 완전히 용해될 때까지 혼합합니다.

2. 세포 현탁액 준비
- 세포를 배양 접시에서 분리하여 단일 세포 현탁액으로 만듭니다.
- 세포의 생존율을 확인하고, 원하는 밀도를 맞추기 위해 세포 수를 계산합니다.

3. 세포-고분자 혼합
- 준비된 세포 현탁액을 전구체 용액에 부드럽게 혼합합니다. 이때 기포가 생기지 않도록 주의하며, 세포의 응집을 방지하기 위해 신속하게 진행합니다.

4. 겔 성형 및 가교
- 혼합액을 몰드 또는 웰 플레이트에 분주합니다.
- 광원에 노출시켜 광가교를 유도함으로써 하이드로겔을 형성합니다. 조사 강도와 시간은 전구체의 농도와 광개시제의 종류에 따라 최적화해야 합니다.

5. 배양 및 유지
- 가교가 완료된 후, 겔 상단에 신선한 배지를 추가합니다.
- 37°C, 5% $\text{CO}_2$ 인큐베이터에서 배양하며, 정기적으로 배지를 교체하여 세포의 성장과 분화를 유지합니다.

결과 분석
- 공초점 현미경(Confocal microscopy)을 사용하여 겔 내 세포의 분포와 형태를 관찰합니다.
- 라이브/데드(Live/Dead) 염색을 통해 세포 생존율을 평가합니다.
- RT-qPCR 또는 면역형광 염색을 통해 특정 마커의 발현을 분석하여 세포의 분화 상태를 확인합니다.</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리 튜브</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>CT-002-15A</td><td></td></tr><tr><td>2.5 &amp;micro;L 피펫 팁</td><td>Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.</td><td>B10T</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 피펫 팁</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>T-001-200</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리 튜브</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>CT-002-50A</td><td></td></tr><tr><td>96웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>가변 용량 단일 채널 피펫, 0.1&amp;ndash;2.5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf SE</td><td>3120000216</td><td></td></tr><tr><td>조절식 단일 채널 피펫, 100&amp;ndash;1000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf SE</td><td>3120000267</td><td></td></tr><tr><td>가변 용량 단일 채널 피펫, 20$\mu$L&amp;ndash;200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf SE</td><td>3120000259</td><td></td></tr><tr><td>조절식 단일 채널 피펫, 2&amp;ndash;20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf SE</td><td>3120000232</td><td></td></tr><tr><td>&lt;이름=&quot;범위!A13&quot;&gt;세포 배양 접시&lt;/a&gt;</td><td>Corning Incorporated</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>냉동 보관 튜브</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>BS-20-ST</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드 (DMSO)</td><td>Beijing Solarbio Science &amp;amp; Technology Co., Ltd.</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies Limited</td><td>11966-025</td><td>본 연구에서는 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin Solution 및 89% DMEM을 사용하여 완전 DMEM을 제조하였습니다.</td></tr><tr><td>ESCO CelCulture CO2 인큐베이터&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 배양기</td><td>Esco Micro Pte. Ltd.</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>소태아혈청 (FBS, Superfine)</td><td>Procell Life Science &amp;amp; Technology Co.,Ltd.</td><td>164210-50</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 형광 염료</td><td>Beijing Solarbio Science &amp;amp; Technology Co., Ltd.</td><td>B8040</td><td></td></tr><tr><td>HT22 세포</td><td>Procell Life Science &amp;amp; Technology Co.,Ltd.</td><td>CL-0697</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>미국 국립보건원</td><td></td><td>ImageJ는 본 원고에서 사용된 이미지 처리 소프트웨어 중 하나입니다.</td></tr><tr><td>ImageXpress Micro 컨포컬 고함량 이미징 시스템</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>ImageXpress Micro 공초점 현미경</td><td>원고에서는 다음을 사용하십시오. &quot;고함량 이미지 분석 시스템&quot; 기기 명칭의 대체어로.</td></tr><tr><td>저속 냉동 원심분리기</td><td>Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.</td><td>L530R</td><td></td></tr><tr><td>MetaXpress 고함량 이미지 획득 및 분석 소프트웨어</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td></td><td>본 소프트웨어는 ImageXpress의 보조 소프트웨어입니다.&amp;reg; 마이크로 공초점 고함량 이미징 시스템. 원고에서, &quot;장치와 함께 제공되는 분석 소프트웨어&quot; 이 소프트웨어를 지칭합니다.</td></tr><tr><td>OptiMair 수직 층류 작업대</td><td>Esco Micro Pte. Ltd.</td><td>ACB-4E1</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Pechiney Plastic Packaging Inc.</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>인산완충식염수</td><td>&amp;nbsp;Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd&amp;nbsp;</td><td>YC-5013</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Procell Life Science &amp;amp; Technology Co.,Ltd.</td><td>PB180120</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 용액 (PI)</td><td>Beijing Solarbio Science &amp;amp; Technology Co., Ltd.</td><td>C0080</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 용액</td><td>BasalMedia Technology Co.,Ltd.</td><td>S310KJ</td><td></td></tr></tbody></table>

고함량 이미징 및 데이터 처리를 위한 표준화된 워크플로

Standardized Workflow for High-Content Imaging and Data Processing

과학 연구 이미징에서 작업자 간 편차로 인한 낮은 재현성 문제와 기존 방법으로 다수의 샘플을 분석할 때 발생하는 복잡성을 해결하기 위해, 본 연구에서는 HT22 세포를 PI 및 Hoechst 33342로 염색한 후 High-Content Imaging System을 사용하여 데이터를 이미징하고 분석하는 프로토콜을 소개합니다. 이 워크플로우는 견고한 이미징 설정 파라미터와 엄격한 품질 관리 표준을 수립하는 것을 목표로 합니다. 본 프로토콜은 장비의 이미징 설정과 해당 장비에서 제공하는 세 가지 서로 다른 이미지 처리 방법인 Multi-Wavelength Cell Scoring (Multi), Live-Dead (Live), Custom Module Editor (CME)의 워크플로우를 시연합니다. 각 이미지 처리 방법의 효율성을 보장하기 위해 전통적인 방법인 ImageJ와 비교 및 검증을 수행하였습니다. 궁극적으로 본 연구는 PI 및 Hoechst 이중 염색법을 이용하여 세포 생존율을 결정하기 위한 High-Content Imaging System 활용 워크플로우를 정리합니다. 전체 이미징 및 데이터 처리 워크플로우를 표준화함으로써, 본 연구는 과학 연구 이미징의 재현성과 신뢰성을 크게 향상시켰으며, 이를 통해 실험실 간 데이터 비교를 위한 견고한 방법론적 지원을 제공하고 과학 연구 발전에 기여하고자 합니다.

표준화된 준비 과정이 영상 품질에 미치는 영향
기기가 세포 이미지 층을 안정적으로 찾을 수 있도록 플레이트 파라미터를 설정하였습니다. 적절한 합류도(confluence)를 가진 단일 세포층으로 준비된 시료는 서로 다른 대물렌즈 배율에서 이미지 초점 조절을 용이하게 했으며, 이미지 인식 및 정량 분석 능력을 향상시켰습니다. 표준화된 시료 준비와 최적화된 플레이트 파라미터를 통해 가장자리 효과(edge effects), 세포 중첩 및 기타 이미지 품질 저하 요인들을 효과적으로 최소화하였습니다(그림 1).
이미지 계산 방법 함수의 비교
생세포와 사세포를 구분하기 위해 PI/Hoechst 33342 이중 염색법을 사용하였다. Multi-Wavelength Cell Scorin...

본 연구에서는 자동화된 이미지 획득 및 분석 워크플로우를 사용하여 재현 가능한 세포 생존율 분석을 수행하기 위해, propidium iodide (PI)/Hoechst 33342로 염색된 세포의 표준화된 고함량 이미징 및 데이터 처리 프로토콜을 제시합니다.

과학 연구 영상 촬영의 조작상 변동으로 인한 낮은 재현성 문제와 대량의 데이터를 분석하는 복잡성을 해결하기 위해...

standardized-workflow-for-high-content-imaging-and-data-processing

Research

JoVE Journal

Biology

관할 transmembrane 수용체를 신호 소설의 식별을위한 높은 콘텐츠를 심사 방법은 설명되어 있습니다. 이 방법은 대규모 자동화 의무가 있으며, 수에 대한...

표현 복제가 Grb2 신호 복합 단지를 공부하기 위해 높은 콘텐츠 이미징 워크 플로우

형광 표지 된 세포의 다중 이미지 기반 분석을 가능하게하는 유연한 정보학 워크 플로우입니다 발표. 워크 플로는 핵 및 세포질 마커를 정량화하고 이러한 구획 사이에 마커 전위를 계산한다. 절차 96- 웰 포맷으로 간접 면역 형광에 의해 마커 검출 용 siRNA를 안정적인 방법을 사용하여 세포의 섭동 제공된다.

높은 콘텐츠, 오픈 소스 소프트웨어에 의해 지원되는 범용 현미경 데이터에서 형광 마커, 개별 셀 정량화를위한​​ 워크 플로우

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

여기 우리는 widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템 (WHCAS)를 사용 하 여 슬라이드에 붙일 레이블된 조직의 자동화 된 세그먼트에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 생물 과학, 의료 공학, 건강 과학 등 생물 조직에서 형광 표식의 정량과 관련 된 모든 분야에서 광범위 한 응용 프로그램 있다.

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

거대분자의 고분해능 cryo-EM 맵은 또한 200kV TEM 현미경을 사용하여 달성할 수 있다. 이 프로토콜은 200kV TEM을 사용하여 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 수집하는 데 필수적인 정확한 광학 정렬, 데이터 수집 체계 및 이미징 영역 선택을 설정하는 모범 사례를 보여줍니다.

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

이 프로토콜은 레이저 미세 해부를 사용하여 조직학적으로 해결된 세포 집단의 농축을 위해 염색된 얇은 조직 섹션 이미지로부터 병리학적으로 확인된 관심 영역의 인공 지능 기반 세분화를 위한 고처리량 워크플로우를 설명합니다. 이 전략에는 관심 있는 세포 집단을 나타내는 경계선을 레이저 현미경으로 직접 전송할 수 있는 새로운 알고리즘이 포함되어 있습니다.

종양 미세환경의 미세스케일 프로테오믹 분석을 위한 산업화된 인공 지능 유도 레이저 미세 해부

IBEX(Iterative-bleaching-extends-multiplexity)와 상용 뉴클레오티드 표지 분석(Click-iT EdU)의 조합은 고정된 냉동 쥐 조직 절편에서 매우 역동적인 과정에서 분열하는 세포 유형을 검출하고 분류할 수 있습니다. 또한 새로운 오픈 소스 이미지 처리 파이프라인은 처리량이 많은 이미지 획득 및 분석을 제공합니다.

조직 샘플의 피부 세포 표현형 및 증식 상태를 평가하기 위한 고처리량 이미징 및 분석 워크플로우

이 문서에서는 다양한 세포 밀도에서 검증된 오픈 소스 실행 프로그램을 사용하여 이미지 기반 핵 정량화를 자동화하는 단계별 방법을 설명합니다. 이 프로그램은 비용, 제한된 기술 역량을 가진 사용자의 접근성 및 기존 기술의 유용성을 제한할 수 있는 애플리케이션별 검증과 관련된 장벽을 해결하는 대안을 제공합니다.

Computer Vision 라이브러리를 사용하여 핵 정량 분석 간소화

수동 IBEX 방법을 사용하여 저비용의 다목적 광조사 기술을 구현하면 상당한 네이티브 자가형광으로 인체 조직을 최적으로 이미징할 수 있습니다. 이 프로토콜은 도립 현미경, 널리 사용 가능한 시약 및 이미지 정렬 및 처리를 위한 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 보관된 임상 샘플에서 다중화된 전체 슬라이드 이미지를 얻는 방법을 자세히 설명합니다.

반복적인 표백을 위해 최적화된 워크플로우는 고도의 자가형광 임상 샘플의 멀티플렉시티 이미징을 확장합니다.

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

말초 혈액과 골수의 자동화된 디지털 세포형태학 워크플로우를 설명합니다. 표준화된 도말 준비와 염색 후, 스캐너가 시체 이미지를 촬영합니다. AI 기반 소프트웨어는 핵화된 세포를 찾아내고 기록하며 예비 분류한 뒤 전문가의 검토를 진행합니다. 오진 가능성이 있는 중요한 세포 오분류에 초점을 맞추고 있습니다.

중요한 세포 잘못분류를 고려한 자동화된 디지털 말초 혈액 및 골수 세포형태학 워크플로우

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine.  Here, we present a protocol for standardized high-content imaging and data processing of propidium iodide (PI)/Hoechst 33342-stained cells to perform reproducible cell viability analysis using automated image acquisition and analysis workflows.

고함량 이미징 및 데이터 처리를 위한 표준화된 워크플로

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