Name: Eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Leer een minimaal invasieve nierinjectietechniek voor fluorescent gemicroniseerde deeltjes in volwassen Danio rerio. Deze methode maakt herhaalde in vivo metingen van bloed-pH mogelijk via intravital beeldvorming van de kieuwen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Auteurs erkennen sterk de hulp van Bogdan Osadchiy en Evgenii Protasov (Irkoetsk State University, Rusland) ter voorbereiding van het protocol van de video. Dit onderzoek werd gesteund door de Russische Science Foundation (#15-14-10008) en de Russische Stichting voor fundamenteel onderzoek (#15-29-01003).

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijn 2010/63/EG voor dierproeven en zijn goedgekeurd door het dier onderwerpen onderzoek Comité van Instituut Biologie aan de Universiteit van de staat van Irkoetsk.
1. fabricage van Microcapsules
Opmerking: De Microcapsules uitvoering een fluorescente kleurstof worden bereid met een laag-voor-laag-vergadering van tegengesteld geladen polyelectrolytes7,8. Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
<ol><li>Om te synthetiseren poreuze CaCO3 microcores bijvoeging van de fluorescente kleurstof, Meng 2 mL van de oplossing van de SNARF-1-dextran (de meeste polymeer-gebonden fluorescente kleurstof zoals FITC-BSA kan worden gebruikt) met een concentratie van ~ 2 mg/mL met 0,6 mL elk van 1 mol/L-oplossingen van CaCl2 en Na2CO3 snel roeren. Opmerking: Aandacht besteden aan de verschillende gevoeligheden van fluorescente kleurstoffen aan photobleaching; Als een lichtgevoelige fluorescente sonde (zoals SNARF-1) wordt gebruikt, moeten de manipulatie en de opslag van de deeltjes worden uitgevoerd met zo weinig licht mogelijk.</li>
	<li>Na 5-10 s van agitatie, spoel de suspensie 2 mL microcentrifuge buizen en centrifuge voor 15 s bij 10.000-12.000 g tot pellet CaCO3 microcores.</li>
	<li>Verwijder het supernatant, wassen van de kernen met ~ 2 mL gedeïoniseerd water en resuspendeer de pellet door schudden.</li>
	<li>Herhaal de procedure centrifugeren-wassen drie keer in totaal. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant.</li>
	<li>Incubeer de microcores gedurende 1 minuten in een ultrasoonbad om hun aggregatie. Let op: Vergeet niet om de oren met koptelefoon te beschermen.</li>
	<li>Om te storten de eerste polymeer laag van de sjablonen, resuspendeer de kernen in ~ 2 mL van een 4 mg/mL oplossing van poly(allylamine hydrochloride) (PAH) in 1 mol/L NaCl.<ol>
<li>Houd de microcores in de oplossing voor ~ 5 min met constante schudden.</li>
		<li>Na 15 albums van centrifugeren, verwijder het supernatant met de niet-afhankelijke PAH. De overdekte microcores met gedeïoniseerd water minstens 3 maal door middel van meerdere centrifugeren en wassen stappen wassen. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant.</li>
		<li>Incubeer de microcores gedurende 1 minuten in een ultrasoonbad om hun aggregatie. Opmerking: Als de toegepaste fluorescente kleurstof kationische, begint van poly (natrium-4-styreensulfonaat) (PSS) in 1 mol/L NaCl (zie stap 1.7).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal stap 1.6 met ~ 2 mL van een 4 mg/mL oplossing van PSS (ook met 1 mol/L NaCl) om te storten de tweede polymeer laag van de sjablonen.</li>
	<li>Herhaal stap 1.6 en 1.7 zesmaal te deponeren 12 polymere lagen. Opmerking: Het is niet aanbevolen om een lange pauze (~ 12 h of meer) te nemen in de procedure tot ~ 3-5 lagen zijn nedergelegd omdat CaCO3 microcores zonder dekking kunnen de neiging om recrystallize. Merk op dat PSS dekking een hogere aggregatie van de microcores veroorzaakt en de lange pauze is aan te raden dat alleen wanneer pak of poly-L-lysine met polyethyleenglycol geënt (PLL-g-PEG) is de buitenste laag.</li>
	<li>Incubeer de overdekte microcores in 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL per microtube) gedurende ten minste 2 uur.<ol>
<li>Wassen van de microcores met water via opeenvolgende centrifugeren en resuspensie stappen. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor het verkrijgen van holle microcapsules, Los de CaCO3 sjablonen door toevoeging van 2 mL 0,1 mol/L ethyleendiamminetetra (EDTA) zuuroplossing (aangepast aan de pH 7.1 met NaOH) naar de overdekte microcores.<ol>
<li>Na ~ 5 min van incubatie, centrifugeer de microcapsules voor 45 s en negeren het supernatant met de EDTA.</li>
		<li>Herhaal stap 1.10-1.10.1 tweemaal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen van de microcapsules met 0,9% NaCl driemaal door meerdere centrifugeren binnen 45 stappen s gevolgd door wassen stappen. Na de laatste stap van het centrifugeren, verwijder het supernatant. Opmerking: De uiteindelijke microcapsule oplossing voor injectie moet worden bewaard steriele (bijvoorbeeld door toevoeging van ampicilline, 0,1 mg/mL), en de media moeten biocompatibel met het doel van onderzoek (isotone media met neutrale pH).</li>
	<li>Schatting van de concentratie van de bereid microcapsules in een hemocytometer onder een fluorescentie Microscoop. Neem een serie foto's van de microcapsules, meet de diameter van over de honderd microcapsules ImageJ9 of gelijkwaardige softwarematig en onderzoeken de grootteverdeling met behulp van een histogram.</li>
	<li>Winkel de verkregen ingekapseld sonde in het donker. Opmerking: na enkele wasbeurten in steriele 0.9% NaCl, de microcapsules kunnen worden opgeslagen voor maanden bij 4 ° C. Volledige droging van de microcapsules tijdens de opslag wordt niet aanbevolen.</li>
</ol>2. voorbereiding van optische Setup en kalibratie van Microencapsulated SNARF-1
Opmerking: Ruwe pH metingen met microencapsulated SNARF-1 kan worden gemaakt met behulp van afbeeldingen in twee kanalen van een fluorescente microscoop7, maar in dit protocol een één-kanaals fluorescente microscoop op een vezel-spectrometer aangesloten werd toegepast.
<ol><li>Plaats van de vereiste set fluorescentie filters om de fluorescente microscoop volgens de kenmerken van de toegepaste fluorescente kleurstof en inschakelen van de TL-lamp.<ol>
<li>Trek de hendel aan de oculairs. Let op: Teveel licht kan schade aan de spectrometer-matrix. Dus, zorg ervoor dat de hendel in de modus "oculair" wanneer de spectrometer wordt niet gebruikt.</li>
		<li>Sluit één uiteinde van de optische vezel aan de spectrometer en het andere uiteinde op een collimator. Plaats de collimator met adapters in de focus van de camera-buis of andere beschikbare poort van de fluorescente microscoop.</li>
		<li>Inschakelen van de spectrometer. De spectrometer controleprogramma uitvoeren en stel de spectrometer voor metingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor de kalibratie van de microcapsule partij, ~ 5 µL van de microcapsule ophanging (microcapsules ~ 10 000 per µL in gedeïoniseerd water) op een microscoopglaasje plaats en drogen van de druppel op een donkere plek (bijvoorbeeld in een thermostaat bij 35 ° C).<ol>
<li>Als u wilt kalibreren de spectrale kenmerken van de microencapsulated SNARF-1, door een reeks van buffers met verschillende pH-waarden in het bereik ~ 6-9 te gebruiken. ~ 10 µL van een buffer op de gedroogde microcapsules met SNARF-1-dextran drop en bedek het met een dekglaasje aan.</li>
		<li>Plaats het glasplaatje in het werkgebied van de Microscoop. Zoek de microcapsules met behulp van een × 40 doelstelling.</li>
		<li>Zet de hendel van de Microscoop op de poort van de camera. Registreren hun fluorescentie met de spectrometer. Zet de hendel terug naar de oculairs. Opmerking: Zorg ervoor dat de spectrale signaal is tot ver buiten het achtergrondniveau, en zorgen dat de microcapsules in het gezichtsveld niet in een zeepbel (door over te schakelen naar een lagere vergroting indien nodig). Vermijd langdurige verlichting van de dezelfde microcapsules. SNARF-1 is gevoelig voor photobleaching.</li>
		<li>Herhaal stap 2.2.3 voor verschillende microcapsules 10 - 15 keer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De ratio's van fluorescentie, piek (bijvoorbeeld met behulp van R of Scilab) voor alle geregistreerde spectra berekenen en bepalen van de regressielijn tussen de mediane verhouding (voor elke buffer) en middellange pH met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57491/57491eq1.jpg"> Opmerking: SNARF-1 heeft een spectrum met twee bergtoppen die overeenkomen met de emissie van de kleurstof geprotoneerd en ring, en de verhouding tussen de pieken is reageren op de pH van het medium. In deze studie, wordt de verhouding tussen de intensiteit van de fluorescentie van 605 en 660 nm gebruikt. Deze golflengten worden gekozen afhankelijk van het filter gebruikt. a en b zijn coëfficiënten te bepalen door middel van niet-lineaire regressie (bijvoorbeeld met behulp van R). Waarden 0,15 en 1.1 zijn, respectievelijk, de minimale en maximale waarden van ik605/I660 waargenomen tijdens de kalibratie.</li>
	<li>Ongeveer 10 µL van vis bloed van ongeveer 5 volwassen dieren verzamelen. Plaats vissen in een petrischaal met 1 µL/mL water opschorting van kruidnagel olie voor anesthesie en wacht totdat het dier op zijn kant draait en reageert aan snuifjes van de fin (meestal ~ 2-3 min). Het overbrengen van de vis op een glasplaatje. De staart van de vis met een lancet afgesneden en verzamelen van ongeveer 2 µL van vis bloed uit de ader van de staart. Opmerking: Om te voorkomen dat de bloedstolling, behandelen de incisie met heparine (5000 U/mL) en gebruik van EDTA glazen capillairen en microcentrifuge buizen voor het verzamelen van het bloed.<ol>
<li>Ongeveer 10 µL van bloed met een pipet op het puntje van de micro-elektrode druppelen en bepaal de pH met behulp van een pH-meter.</li>
		<li>Drop het bloed op een dia met gedroogde microcapsules en registreren van de verhouding van de intensiteit van de fluorescentie zoals beschreven voor de kalibratie buffers (stappen 2.2-2.3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aanpassen van de lineaire coëfficiënt van de kalibratiekromme te maken van de curve dat overeenkomt met de metingen in het bloed van de vis (voor meer details zie Borvinskaya et al. 20175).</li>
</ol>3. voorbereiding voor injectie
<ol><li>Laat de stalen naald uit het topje van de insuline pen (of spuit) door het verwijderen van de kunststof met een scherpe lancet. Opmerking: Een dunne naald (Ø0.33 mm of minder) of glazen viscometerbuizen (meestal Ø1 mm) kan worden voorbereid voor microinjection10,11.</li>
	<li>Plaats de naald halverwege in het glas-microcapillary; snel en zachtjes soldeer met behulp van een gas fakkel.</li>
	<li>De glazen microcapillary verbinden met de microinjector en het spoelen met steriel water drie keer. Ervoor zorgen dat de vloeistof door de naald stroomt.</li>
	<li>Vul het systeem met gedestilleerd water. Opmerking: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem.</li>
</ol>4. injectie
<ol><li>Resuspendeer de bereid schorsing van microcapsules (in steriele 0.9% NaCl, of andere media gebruikt voor de injecties, met een concentratie van 0,5 tot 6 miljoen microcapsules per microliter) met behulp van het ultrasoonbad voor 1 min. Opmerking: Aangezien de microcapsules neigen te precipiteren, tijdens de volgende injectie, schud de flacon met de microcapsules mechanisch (met behulp van een rotor) of handmatig elke paar minuten resuspendeer hen en hun aggregatie wordt voorkomen.</li>
	<li>Plaats de vis in een petrischaal met verdoving (0,1 mL/L van kruidnagel olie geschorst in water) voor ~ 2-3 min. wachten totdat de vis op zijn kant draait en reageert op een lichte snuifje van de fin.</li>
	<li>Met behulp van een lepel, overbrengen van de vis uit de verdoving en breng dit voorzichtig op een vochtige spons in een laterale positie met het hoofd naar links (voor rechtshandige persoon) of naar rechts (voor linkshandige persoon).</li>
	<li>Zuigen net vóór de inspuiting, 1-2 mm van lucht in de glazen capillaire verbonden met microinjector. Vervolgens laad het met ongeveer 2 µL van de verspreide microcapsules. Opmerking: Voordat de injectie, de microcapsule oplossing moet worden aangepast aan de temperatuur waarop de vis worden gehouden.</li>
	<li>Zachtjes het stabiliseren van het lichaam van de vis op de spons met niet-dominante hand.<ol>
<li>De zijlijn van de vis te vinden. Mentaal Selecteer een segment dat zich uitstrekt van de operculum aan het einde van de buikholte. Het vinden van het midden van dit segment. Steek de naald 1 mm lager in de ventrale richting.</li>
		<li>Met een schraperig beweging, verplaatsen voorzichtig de vis schalen opzij, en maak een lekke band. Steek de naald in het lichaam in een hoek van 45° naar de tabel oppervlak.</li>
		<li>Duw de nld richting de wervelkolom totdat het zorgvuldig ertegen rust.</li>
		<li>Laat ongeveer 1 µL van de microcapsules schorsing in de nier en de naald langzaam te trekken. Opmerking: Om te zoeken naar de juiste punctie site gemakkelijker, het is handig om te oefenen het vinden van de kofferbak nier door het transilluminating van de vissen die met behulp van een licht van de bodem, zoals weergegeven in figuur 2A en 2B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spoel de vis van kop tot staart met een stroom van water om eventuele gemorste microcapsules op de injectieplaats.</li>
</ol>5. in Vivo visualisatie
<ol><li>Gebruik de dissectie schaar te verwijderen van de gill-cover uit het hoofd van de vis en denude de kieuwen van de vis. Spoel de kieuwen met water.</li>
	<li>Met behulp van een lepel, de vis naar een microscoopglaasje overbrengen, en plaats deze in het werkgebied van de fluorescente microscoop. Opmerking: Zorg ervoor dat de kieuwen van de vis niet tijdens opeenvolgende procedures doen uitdrogen. Om dit te vermijden, periodiek hen bevochtigen met water met behulp van een pipet van Pasteur (ongeveer elke 1-2 min).</li>
	<li>De kamer donkerder en met behulp van lage vergroting (x 10 doelstelling) inspecteren de kieuwen om te vinden de fluorescerende microcapsules. Opmerking: Wanneer de procedure wordt gebruikt voor de invoering van sommige fluorescerende deeltjes in de bloedsomloop van de vis, is het aanbevolen om de kieuwen van verscheidene individuen voor onverwachte fluorescerende deeltjes vóór injecties inspecteren. Kieuwen van wild-type zebrafish hebben geen autofluorescence kunnen, maar in sommige gevallen sporadisch fluorescerende deeltjes (zoals voedsel stukken of eencellige symbionten) aanwezig op de kieuwen. Als nodig, deze deeltjes kunnen worden herkend op basis van hun specifieke vorm (bijvoorbeeld voedsel stukken hebben onregelmatige vorm, in tegenstelling tot de sferische microcapsules) of fluorescentie spectrum (bijvoorbeeld kleur).<ol>
<li>Overschakelen van de lens naar een hogere magnitude (× 40 doelstelling) en een microcapsule of een groep van microcapsules in het midden van het gezichtsveld plaats.</li>
		<li>Zet de hendel met de poort na een aangesloten spectrometer. Record de spectrale signaal.</li>
		<li>Zet de hendel terug naar het oculair.</li>
		<li>Herhaal de metingen voor verschillende microcapsules meerdere malen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De vis overbrengen in het aquarium met goede beluchting voor herstel. Opmerking: Met minimale praktijk is het mogelijk om uit te voeren van de injectie en signaal opnemen met een geschatte snelheid van 2-3 min per vis. De meting kan worden herhaald voor een individuele meerdere malen met het gebruik van herhaalde lage, onschadelijk doses van verdoving of een andere methode van fixatie. Voor de lange termijn waarneming, een systeem met continu verdoving12te gebruiken.</li>
</ol>

<ol><li>Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+microparticles+of+polymers+and+polysaccharides+to+administer+fish+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines.</a> Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).</li>
<li>Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+polyelectrolyte+microcapsules+as+a+contrast+agent+for+photoacoustic+imaging+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood.</a> J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).</li>
<li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).</li>
<li>Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+in+vivo+stress+assessment+of+aquatic+animals+with+microencapsulated+biomarkers+for+environmental+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring.</a> Sci. Rep. 6, e36427(2016).</li>
<li>Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+in+vivo+monitoring+of+pH+in+gill+capillaries+and+muscles+of+fishes+using+microencapsulated+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Open%22%5BJournal%5D)">Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers.</a> Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).</li>
<li>Diep, C. Q., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+cells+directly+into+the+kidney+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (51), e2725(2011).</li>
<li>Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2007/jm/b705419j#!divAbstract">Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors.</a> J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).</li>
<li>Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7452/lapl.201210020">Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo.</a> Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFerreira%2C+T+%22ImageJ+User+Guide+-+Version+1.44%22">ImageJ User Guide - Version 1.44</a>. , 
 <a target="_blank" href="imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ ">imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ </a> (2012).</li>
<li>Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+brain+microinjection+to+study+molecular+substrates+of+motivated+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior.</a> J. Vis. Exp. (103), e53018(2015).</li>
<li>Liu, L., Duff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+serial+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse.</a> J. Vis. Exp. (21), e960(2008).</li>
<li>Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+in+the+brain+of+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish.</a> J. Vis. Exp. (81), e51065(2013).</li>
<li>Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+adult+zebrafish+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of the adult zebrafish kidney.</a> J. Vis. Exp. (54), e2839(2011).</li>
<li>McKee, R. A., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+renal+pathology%3A+Emerging+models+of+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pathobiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury.</a> Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+hollow+polymer+shells+by+colloid-templated+assembly+of+polyelectrolytes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).</li>
<li>Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S092777570300195X">Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication.</a> Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).</li>
<li>Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nl0259333">Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals.</a> Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).</li>
<li>Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+encapsulation+via+porous+CaCO3+microparticles+templating%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).</li>
<li>Tzaneva, V., Perry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Time+differential+staining+technique+coupled+with+full+bilateral+gill+denervation+to+study+ionocytes+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish.</a> J. Vis. Exp. (97), e52548(2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We gebruikten om aan te tonen de injectie van microdeeltjes in de zebravis nier, semi-permeabel microcapsules geladen met een indicator kleurstof. Dus bevat het protocol instructies voor de fabricage van de microcapsules met behulp van de vergadering van de laag-voor-laag van tegengesteld geladen polyelectrolytes7,8,15,16,17 ,18</...

Het beheer van micro-formaat deeltjes in een dierlijke organisme is een belangrijke taak op gebieden zoals drugs en vaccin levering1, therapieën visualization2transgene cel implantatie3en kleine optische sensor implantatie 4 , 5. de implantatie procedure voor microscale deeltjes in het vaatstelsel van kleine laboratoriumdieren is echter moeilijk, vooral voor delicate waterorganismen. Voor specimens van de populaire onderzoek zoals zebrafish, is het raadzaam dat deze procedures worden verduidelijkt met behulp van video protocollen.
Intracardiac en capillaire microinjections nodig opgeleid personeel en unieke microchirurgie voorzieningen voor de levering van microobjects in zebrafish bloed. Eerder, een retro-orbitaal Handleiding injectie3 werd voorgesteld als een gemakkelijke en effectieve methode voor het beheer van hele cellen. Echter in onze ervaring duurt vanwege de kleine oppervlakte van het oog capillaire netwerk, het veel praktijk om het gewenste resultaat van deze techniek.
Hierin beschrijven we een methode voor robuuste en efficiënte microparticle implantatie in de bloedsomloop door Handleiding injectie rechtstreeks in het nierweefsel van volwassen zebrafish, die rijk is aan haarvaten en renale vaartuigen. Deze techniek is gebaseerd op het video protocol voor cel transplantatie in de zebravis nier6, maar de traumatische en tijdrovende microchirurgische stappen werden uitgeschakeld. De voorgestelde methode wordt gekenmerkt door lage sterfte (0-20%) en hoog rendement (70-90% succes), en het is eenvoudig in te stellen met behulp van algemeen beschikbare apparatuur.
Een belangrijk onderdeel van het voorgestelde protocol is de visualisatie van de geïmplanteerde microdeeltjes (als ze TL of colorized zijn) in de haarvaten van gill, dat voorziet in de verificatie van de kwaliteit van de injectie, een ruwe relatieve beoordeling van het aantal ingespoten deeltjes, en de opsporing van de spectrale signaal voor fysiologische metingen vanuit het circulerende bloed. Als een voorbeeld van de mogelijke toepassingen van de beschreven techniek, wij laten zien dat het protocol voor in vivo metingen van zebravis bloed pH met behulp van een microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1, oorspronkelijk voorgesteld in Borvinskaya et al. 20175.

<table><tbody><tr><td>SNARF-1-dextran, 70000 MW</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D3304</td><td>Fluorescente sonde. Elke andere geschikte polymeergebonden fluorescente kleurstof kan worden gebruikt als vulstof voor microcapsules</td></tr><tr><td>Albumine-fluoresceine isothiocyanate conjugaat (FITC-BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A9771</td><td>Fluorescente sonde</td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)</td><td>SIGMA</td><td>R9379</td><td>Fluorescente sonde</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>CaCO3-sjablonenvorming</td></tr><tr><td>Natriumcarbonaat</td><td>SIGMA</td><td>S7795</td><td>CaCO3-sjablonenvorming</td></tr><tr><td>Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)</td><td>SIGMA</td><td>283215</td><td>Katjonisch polymeer</td></tr><tr><td>Poly(natrium 4-styreensulfonaat), MW 70000 (PSS)</td><td>SIGMA</td><td>243051</td><td>Aanionisch polymeer</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine [20 kDa] geënt met polyethyleenglycol [5 kDa], g = 3,0 tot 4,5 (PLL-g-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)</td><td>Laatste polymeer om de biocompatibiliteit van microcapsules te verhogen</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>SIGMA</td><td>S8776</td><td>Voor het oplossen van toegepaste polymeren</td></tr><tr><td>Waterzuiveringssysteem</td><td>Millipore</td><td>SIMSV0000</td><td>Voor het bereiden van gedeïoniseerd water</td></tr><tr><td>Magneetroerder</td><td>Stegler</td><td></td><td>Voor CaCO3-sjablonenvorming</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp;Research&nbsp;plus pipette, 1000 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Doseringsoplossingen</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp;Research&nbsp;plus pipette, 10 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Doseringsoplossingen</td></tr><tr><td>Pipetpunten, volumebereik 200 tot 1000 &micro;L</td><td>F.L. Medical</td><td>28093</td><td>Doseringsoplossingen</td></tr><tr><td>Pipetpunten, volumebereik 0,1-10&nbsp;&mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>Z640069</td><td>Doseringsoplossingen</td></tr><tr><td>Mini-centrifuge Microspin 12, hoge snelheid</td><td>BioSan</td><td></td><td>Voor centrifugatie-wasprocedure van microcapsules</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisjes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>Z666513</td><td>Synthese en opslag van microcapsules</td></tr><tr><td>Shaker Intelli-mixer RM-1L</td><td>ELMY Ltd.</td><td></td><td>Om de aggregatie van microcapsules te verminderen</td></tr><tr><td>Ultrasoonreiniger</td><td></td><td></td><td>Om de aggregatie van microcapsules te verminderen</td></tr><tr><td>Hoofdtelefoons&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Om de oren te beschermen tegen ultrageluid</td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur</td><td>SIGMA</td><td>EDS</td><td>Om de CaCO3-sjablonen op te lossen</td></tr><tr><td>Mononatriumfosfaat</td><td>SIGMA</td><td>S9638</td><td>Bereiding van pH-buffers</td></tr><tr><td>Dinatriumfosfaat</td><td>SIGMA</td><td>S9390</td><td>Bereiding van pH-buffers</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>SIGMA</td><td>S8045</td><td>Om de pH van de EDTA-oplossing en buffers aan te passen</td></tr><tr><td>Thermostaatkamer</td><td></td><td></td><td>Om microcapsules op een glazen plaatje te drogen</td></tr><tr><td>Hemocytometer telkamer voor bloedcellen</td><td></td><td></td><td>Om de grootteverdeling en concentratie van de bereide microcapsules te onderzoeken</td></tr><tr><td>Fluorescente microscoop Mikmed 2</td><td>LOMO</td><td></td><td>In vivo visualisatie van microcapsules in visbloed</td></tr><tr><td>Set van fluorescente filters voor SNARF-1 (moet worden gekozen afhankelijk van het microscoopmodel; voorbeeld wordt gegeven)</td><td>Chroma</td><td>79010</td><td>Visualisatie van microcapsules met fluorescente sondes</td></tr><tr><td>Fiber spectrometer QE Pro</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Calibratie van microcapsules onder microscoop</td></tr><tr><td>Optische vezel QP400-2-VIS NIR, 400 &mu;m, 2 m</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td>Om spectrometer met microscooppoort te verbinden</td></tr><tr><td>Collimator F280SMA-A</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>Om spectrometer met microscooppoort te verbinden</td></tr><tr><td>Glaze microscoopplaatje</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Calibratie van microcapsules onder microscoop</td></tr><tr><td>Dekvlakken, 22 x 22 mm</td><td>Pearl</td><td>MS-SLIDCV</td><td>Calibratie van microcapsules onder microscoop</td></tr><tr><td>Glazen microcapillairen Intra MARK, 10 &micro;L</td><td>Blaubrand</td><td>BR708709</td><td>Om visbloed te verzamelen</td></tr><tr><td>Kluuntjesolie</td><td>SIGMA</td><td>C8392</td><td>Visanesthesie</td></tr><tr><td>Lancet No 11</td><td>Apexmed international B.V.</td><td>P00588</td><td>Om de visstaart te snijden en de stalen naald los te maken van de punt van de insuline-auto-injector</td></tr><tr><td>Heparine, 5000 U/mL</td><td>Calbiochem</td><td>L6510-BC</td><td>Voor het behandelen van alle oppervlakken die in contact komen met visbloed tijdens het verzamelen van visbloed</td></tr><tr><td>Seven 2 Go Pro pH-meter met micro-elektrode</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Om de pH van visbloed te bepalen</td></tr><tr><td>Insulinepennaalden Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>Voor injectieprocedure. Elke dunne naald (&Oslash; 0,33 mm of minder) is geschikt</td></tr><tr><td>Glazen capillairen, 1 x 75 mm</td><td>Hirschmann Laborger&auml;te GmbH &amp; Co</td><td>9201075</td><td>Voor injectieprocedure</td></tr><tr><td>Gasbrander</td><td></td><td></td><td>Om stalen naald aan glazen capillair te solderen</td></tr><tr><td>Microinjector IM-9B</td><td>NARISHIGE</td><td></td><td>Voor nauwkeurige dosering van microcapsules suspensie</td></tr><tr><td>Petrischalen, 60 mm x 15 mm, polystyreen</td><td>SIGMA</td><td>P5481</td><td>Voor manipulaties met vissen onder anesthesie</td></tr><tr><td>Kunststof lepel</td><td></td><td></td><td>Voor manipulaties met vissen onder anesthesie</td></tr><tr><td>Vochtige spons</td><td></td><td></td><td>Voor manipulaties met vissen onder anesthesie</td></tr><tr><td>Dissectie-schaar</td><td>Thermo Scientific</td><td>31212</td><td>Om de kieuwdeksel van het vishoofd te verwijderen</td></tr><tr><td>Pasteurpipet, 3,5 mL</td><td>BRAND</td><td>Z331767</td><td>Om vis

eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

De systemische toediening van micro-formaat deeltjes in een levend organisme kan worden toegepast voor therapieën visualisatie, drugs en levering van vaccin, implantatie van transgene cellen en kleine optische sensoren. Echter intraveneuze microinjections in kleine dieren, die meestal in biologische en veterinaire laboratoria worden gebruikt, zijn zeer moeilijk en vereist opgeleid personeel. Hierin tonen wij een robuuste en efficiënte methode voor het binnenbrengen van deeltjes in de bloedsomloop van volwassen zebravissen (Danio rerio) door injectie in de nier vis. Om te visualiseren de geïntroduceerde microdeeltjes in de therapieën, stellen wij voor een eenvoudige intravital beeldvormende techniek in de kieuwen van de vis. In vivo monitoring van de zebravis bloed pH werd uitgevoerd met behulp van een ingespoten microencapsulated TL probe, SNARF-1, om aan te tonen een van de mogelijke toepassingen van de beschreven techniek. Dit artikel bevat een gedetailleerde beschrijving van de inkapseling van pH-gevoelige kleurstof en toont aan de beginselen van de snelle injectie en visualisatie van de verkregen microcapsules voor in vivo opname van het fluorescerende signaal. De voorgestelde methode van injectie wordt gekenmerkt door een laag sterftecijfer (0-20%) en hoog rendement (70-90% succes), en het is eenvoudig in te stellen met behulp van algemeen beschikbare apparatuur. Alle beschreven procedures kunnen worden uitgevoerd op andere kleine vissoorten, zoals guppies en medaka.

De verkregen resultaten komen uit een van de drie belangrijkste categorieën van de gepresenteerde protocol: de vorming van fluorescerende microdeeltjes door inkapseling van een fluorescente kleurstof (Figuur 1), de nier injectie van microcapsules met verdere visualisatie in Gill haarvaten (Figuur 2 en 3) en, ten slotte, het in vivo spectrale opnemen van SNARF-1 fluorescentie te controler...

Dit artikel demonstreert de beginselen van een snelle, minimaal invasieve injectie van fluorescerende microdeeltjes in de circulatory system van kleine vissen en de visualisatie in vivo van het microdeeltjes in vis bloed.

Eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Het algemene doel van deze procedure is het demonstreren van een techniek voor het introduceren van microdeeltjes in het bloedsomloopstelsel van volwassen zebravis door injectie in de nier van de vis. De geïntroduceerde microdeeltjes worden vervolgens in de vaten gevisualiseerd met een eenvoudige techniek van intravitale beeldvorming in de kieuwen van de vis. Deze procedure kan bijvoorbeeld worden gebruikt om herhaalde metingen van de pH van het visbloed in vivo uit te voeren door de introductie van micro-ingekapselde fluorescente probes voor pH.Om dit te bereiken, wordt in de eerste fase de pH-gevoelige kleurstof SNARF-1, geconjugeerd met dextran, ingekapseld in een semi-permeabele polyelektrolytschil met behulp van een layer-by-layer-benadering. De fluorescerende kleurstof wordt co-geprecipiteerd in poreuze microkernen van calciumcarbonaat, waarna de kernen worden gecoat met meerdere lagen tegengesteld geladen, niet-biologisch afbreekbare polymeren en afgewerkt met een topcoating van een biocompatibel polymeer dat polyethyleenglycol bevat. Vervolgens worden de calciumcarbonaatkernen opgelost om volledige microcapsules te verkrijgen die SNARF-1 omsluiten.Tijdens de tweede fase van

simple-effective-administration-visualization-microparticles

Research

JoVE Journal

Biology

Hier laten we zien hoe retro-orbitale injectie te doen in volwassen zebravissen.

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

Beschrijven we een techniek van microinjecting de aminoglycoside, gentamicine, in 2 dagen na de fetilization (DPF) zebravis larven tot acute nierschade (AKI) te induceren. We hebben ook een methode voor het ganse berg immunohistochemie te beschrijven, plastic inbedden en snijden van de zebravis larven aan de AKI gemedieerde schade te visualiseren.

Intraveneuze micro-injecties van de zebravis Larven tot acute nierschade Study

This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

De zebravis is een populaire tool voor het modelleren chronische nierziekte (CKD). Echter, hun kleine formaat maakt het onmogelijk om de nierfunctie te evalueren met behulp van traditionele methoden. We beschrijven een fluorescerende kleurstof nier speling assay 1 dat kwantitatieve analyse van de zebravis nierfunctie bij CKD maakt.

Evaluatie van de zebravis Kidney Functie Met behulp van een TL-Ontruiming Assay

De hier beschreven methode maakt time-lapse analyse van orgaanontwikkeling in zebravisembryo's met behulp van een fluorescentie microscoop ontleden kan uitvoeren optische sectie en simpele strategieën afstelling van focale vlak drift corrigeren.

Analyse van de zebravis Kidney Development met Time-lapse Imaging Met behulp van een dissectie microscoop Uitgerust voor Optische-Sectie

Renal verwondingen opgelopen van nephrotoxins, die drugs, variërend van antibiotica tot chemotherapeutica omvatten, kan leiden tot complexe aandoeningen waarvan de pathogenese blijft onvolledig begrepen. Dit protocol laat zien hoe zebravis kan worden gebruikt voor ziektemodel van deze aandoeningen, die kunnen worden toegepast voor het identificeren van renoprotectieve maatregelen.

Nefrotoxische substantie Micro-injectie in zebravis tot acuut nierfalen Model

Microinjection van zebravis embryo's en larven is een essentieel maar uitdagende techniek gebruikt in vele zebrafish modellen. Hier presenteren we een scala van microscale instrumenten om te helpen bij de stabilisatie en de oriëntatie van de zebravis voor zowel microinjection en beeldbewerking.

Microstructured apparaten voor geoptimaliseerde Microinjection en beeldvorming van zebravis larven

Presenteren wij gebruik van 2-foton microscopie te plaatsen van een micropipet binnen de urine ruimte Bowman in muizen, 2 fundamentele technieken van renale fysiologie combineren. Gebruik van 2-foton microscopie overwint kritische beperkingen van conventionele microscopie voor micropuncture renale fysiologie studies.

Micropuncture van Bowman ruimte in muizen vergemakkelijkt door 2 foton microscopie

Een nieuwe intraperitoneale (IP) injectiemethode bij volwassen zebravissen wordt beschreven. Bij het hanteren van giftige stoffen zoals doxorubicine is deze procedure effectiever dan de twee eerder gerapporteerde IP-methoden. De techniek is zo ontworpen dat het gemakkelijk kan worden toegepast door onderzoekers met beperkte ervaring in het zebravismodel.

Een intraperitoneale injectietechniek bij volwassen zebravissen die lichaamsschade en bijbehorende sterfte minimaliseert

Hier presenteren we een geoptimaliseerd en effectief protocol voor de intraveneuze injectie van cellen of farmacologische middelen in volwassen zebravissen, wat resulteert in verbeterde celtransplantatie en verhoogde overlevingskansen van de behandelde zebravissen.

Geoptimaliseerde intraveneuze injectie bij volwassen zebravissen

Leer een minimaal invasieve nierinjectietechniek voor fluorescent gemicroniseerde deeltjes in volwassen Danio rerio. Deze methode maakt herhaalde in vivo metingen van bloed-pH mogelijk via intravital beeldvorming van de kieuwen.

Eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie

Meer video's verkennen