ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
	<li>Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471&#8211;487.</li>
	<li>Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.</li>
	<li>Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312&#8211;318.</li>
	<li>Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108&#8211;115.</li>
	<li>Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284&#8211;2301.</li>
	<li>Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167&#8211;174.</li>
	<li>Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63&#8211;71.</li>
	<li>Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31&#8211;34.</li>
	<li>Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155&#8211;159.</li>
	<li>Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553&#8211;557.</li>
	<li>Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22&#8211;28.</li>
	<li>Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651&#8211;5656.</li>
	<li>Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201&#8211;216.</li>
	<li>Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893&#8211;901.</li>
	<li>Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.</li>
	<li>Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163&#8211;168.</li>
	<li>Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995&#8211;10000.</li>
	<li>Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229&#8211;7234.</li>
	<li>Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.</li>
	<li>Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510&#8211;518.</li>
	<li>Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.</li>
	<li>Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474&#8211;1483.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>PCR reacties (Tabellen 1, 3)</td></tr><tr><td>10X PBS, pH 7.4</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>Kleurstofbasisbuffer (Stappen 3.2&ndash;3.3)</td></tr><tr><td>5X Q5 Reactiebuffer</td><td>NEB</td><td>B9027S</td><td>Wordt apart verkocht; ook inbegrepen bij Q5 polymerase</td></tr><tr><td>Agar, Bacto</td><td>BD Difco</td><td>281230-500g</td><td>SDCAA-agarplaten (Tabel 5); 15 g/L</td></tr><tr><td>Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Gelelektroforese</td></tr><tr><td>Anti-FLAG PE Antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>637309</td><td>FACS-kleuring; PE-geconjugeerd anti-FLAG</td></tr><tr><td>Anti-HA Tag Antilichaam [FITC]</td><td>GenScript</td><td>A01621</td><td>FACS-kleuring; FITC-geconjugeerd anti-HA</td></tr><tr><td>Bacto Casaminozuren</td><td>BD Difco</td><td>223120</td><td>SDCAA+, SGCAA+, SCAA-media (Tabel 5); 5 g/L</td></tr><tr><td>Bacto Peptone / Tryptone</td><td>RPI</td><td>T60060-10000.0</td><td>LB/SOB-mediavoorbereiding; 20 g/L in YPD (Tabel 5)</td></tr><tr><td>BSA, bovien serumalbumine, fractie V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126575-10GM</td><td>0,5% in PBS; kleurstofbuffer (Stappen 3.2&ndash;3.3)</td></tr><tr><td>BsmBI-v2 (200 U)</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td>Golden Gate-assemblage van substraatcassette (Tabel 8)</td></tr><tr><td>Calciumchlorideoplossing (1M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100mL</td><td>Elektroporatiebuffer: 1 mM eindconcentratie (Tabel 5)</td></tr><tr><td>ColiRollers&reg; Beplatingskralen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71013-3</td><td>Steriliseren door te plaatsen in reagentenflessen en autoclaven bij 121&ordm;C, 15 psi, gedurende 15 minuten.</td></tr><tr><td>D-Galactose</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12813.30</td><td>250 g; 20% w/v-voorraad voor SGCAA+-inductie (Tabel 5)</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Thermo Fisher</td><td>1327300.10</td><td>Elektroporatiebuffer (1 M) en uitgroeimedia (Tabel 5)</td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glucose), anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>YPD, SDCAA+, 20% w/v-dextrosevoorraad (Tabel 5)</td></tr><tr><td>Difco Giststikstofbasis zonder aminozuren</td><td>Sigma</td><td>Y0626-250G</td><td>6,7 g/L in SDCAA/SGCAA (Tabel 5)</td></tr><tr><td>Difco YPD-bouillon (voorgemengd)</td><td>BD</td><td>242820-500g</td><td>Voorbereide YPD-alternatief; 500 g</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Conditiebuffer: 10 mM eindconcentratie; doseer 250 μL, bewaar -20&deg;C</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. CyclePure PCR-zuiveringsuitrusting</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6492-02</td><td>PCR-productopruiming</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Gelextractiekit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D2500-01</td><td>Gelzuivering na PCR en restrictiedigest (Stappen 1.1.8, 1.3.2)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmide DNA Mini Kit I</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6942-02</td><td>Plasmide-zuivering (Stap 4.2)</td></tr><tr><td>Glycerol (&ge;99%)</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td>50% v/v-voorraad voor glycerolvoorraden (Stap 4.1.1)</td></tr><tr><td>Kanamycinesulfaat&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>SDCAA+ en SGCAA+: 50 μg/mL eindconcentratie; vervangt Sigma K0879-5G</td></tr><tr><td>KLD-enzymmix</td><td>NEB</td><td>M0554S</td><td>Kinase-Ligase-DpnI; plaatsgerichte mutagenese</td></tr><tr><td>KLD-reactiebuffer</td><td>NEB</td><td>B0554A</td><td>Wordt gebruikt met KLD-enzymmix</td></tr><tr><td>LB-bouillon (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td>E. coli vloeibare kweek</td></tr><tr><td>Lithiumacetaatdihydraat (LiOAc&middot;2H2O)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A17921.30</td><td>Conditiebuffer: 0,1 M eindconcentratie; toevoegen voor DTT (Tabel 5)</td></tr><tr><td>Luria-agar (Luria-Bertani-agar)</td><td>RPI</td><td>L24020-2000.0</td><td>E. coli-beplating; vervangt Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG</td></tr><tr><td>OmniPur Casaminozuren</td><td>Sigma</td><td>2240-500GM</td><td>Alternatieve casaminozuurbron</td></tr><tr><td>pDD1523</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP</td></tr><tr><td>pDD1524</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycineoplossing, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>SDCAA+, SGCAA+: 1X eindconcentratie</td></tr><tr><td>PstI-HF (5000 U)</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td>Vectorlinearisatie (Tabel 10); gebruik HF-versie</td></tr><tr><td>Q5 HF DNA-polymerase</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Hoge-fidelity-polymerase; alternatief voor Q5 Hot Start</td></tr><tr><td>Q5 High GC Enhancer</td><td>NEB</td><td>B9028A</td><td>Voor PCR-reacties met hoog GC-gehalte</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start DNA-polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>PCR-samenstelling en -amplificatie (Tabellen 1, 3)</td></tr><tr><td>rCutSmart-buffer (10X)</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Meegeleverd met PstI-HF en SphI-HF (Tabel 10)</td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>NEB</td><td>R3138L</td><td>Aan

geoptimaliseerde workflow voor gistoppervlakteweergave voor gerichte evolutie van proteasen

Optimized Yeast Surface Display Workflow for Directed Evolution of Proteases

Geoptimaliseerde workflow voor gistoppervlakteweergave voor gerichte evolutie van proteasen

Directed evolution mimics the natural evolutionary process in a fast, controlled laboratory environment to evolve proteins with desirable functions or ...

optimized-yeast-surface-display-workflow-for-directed-evolution

Research

JoVE Journal

Bioengineering

We presenteren een gedetailleerd protocol om mutantenbibliotheken te construeren en te screenen voor gerichte evolutiecampagnes in Saccharomyces cerevisiae.

Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Dit protocol beschrijft de essentiële stappen voor het uitvoeren van selectiecampagnes voor gistoppervlakken om eiwitvarianten te verrijken die binden aan een interessant antigeen.

Eiwittechniek door gist Surface Display

Hier introduceren we een protocol voor het gebruik van substraten met gistoppervlak voor enzymatische modificatietests. Het platform werd gedemonstreerd met behulp van de analyse van de defosforyleringsactiviteit van tyrosinefosfatase SHP-2 tegen een van zijn substraten als een representatieve enzymatische modificatietest.

Enzymatische modificatie en beoordeling van flowcytometrie van door het gistoppervlak weergegeven eiwitten

Een veelzijdige plasma lithografie techniek is ontwikkeld om stabiel oppervlak patronen te genereren voor de begeleiding van cellulaire bevestiging. Deze techniek kan toegepast worden op mobiele netwerken, inclusief degenen die natuurlijke weefsels na te bootsen en is gebruikt voor het bestuderen van meerdere, verschillende celtypes te creëren.

Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

Dit protocol laat zien methoden die worden gebruikt om 2D-en 3D-omgevingen tot stand in de speciaal ontworpen electrotactic kabinet, kan volgen...

Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen

Een beschrijving van de vorming van een polymeer met een microarray on-chip fotopolymerisatie techniek. De high throughput oppervlaktekarakterisering behulp van atomic force microscopy, water contacthoekmetingen, X-ray foto-elektron spectroscopie en vluchttijden secundaire ionen massaspectrometrie en celhechting assay wordt ook beschreven.

Polymeer Microarrays voor High Throughput Ontdekking van biomaterialen

We beschrijven hier de werking van een microfluïdische apparaat dat continue en hoge-resolutie microscopische beeldvorming van enkele ontluikende gistcellen kunnen gedurende hun volledige replicatie en / of chronologische levensduur.

Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

Biocompatibele pH responsieve sol-gel nanosensors kan in poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) electrospun steigers worden opgenomen. De geproduceerde zelfrapportage steigers kunnen worden gebruikt voor in situ bewaking van micromilieu omstandigheden tijdens het kweken van cellen op de scaffold. Dit is gunstig als de 3D cellulaire construct kan in real-time zonder de proef.

Zelfrapportage Stellingen voor 3-dimensionale Cultuur van de Cel

De driedimensionale stroom kamer inrichting een...

A Novel Driedimensionale Flow Kamer Device aan chemokine-gerichte extravasatie van Cellen doorgeven Studie onder Fysiologische stroomtoestanden

The University of Texas at Dallas.  Dit protocol biedt een geoptimaliseerde workflow voor de gerichte evolutie van virale proteasen in Saccharomyces cerevisiae met behulp van een selectiesysteem gebaseerd op oppervlakteweergaven. Het beschrijft het ontwerp van DNA-insert-bibliotheek en substraatcassettes, elektroporatie geoptimaliseerd voor hoge transformatie-efficiëntie, fluorescentie-geactiveerde celsortering voor protease-splitsing en sequencing van verrijkte v...

Geoptimaliseerde workflow voor gistoppervlakteweergave voor gerichte evolutie van proteasen

Meer video's verkennen