Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
Wykorzystując analizy transkryptomiczne typu bulk, pojedynczych komórek oraz analizy przestrzenne, wraz z modelowaniem przeżycia opartym na uczeniu maszynowym i walidacją eksperymentalną, niniejsze badanie wskazuje PPARG jako kandydata na gen prognostyczny związany z procesem starzenia w osteosarcoma oraz wiąże jego obniżoną ekspresję ze złym rokowaniem przeżycia w bazie TARGET-OS oraz z cechami naczyniowymi i mikrootoczeniowymi.
Kostniak złośliwy pozostaje wyzwaniem w przypadkach przerzutowych, nawrotowych lub opornych na terapię. Celem niniejszego badania była identyfikacja genów prognostycznych związanych z procesem starzenia się komórek oraz charakterystyka ich kontekstów przestrzennych. W zbiorze GSE99671 przeprowadzono analizę różnicowej ekspresji par za pomocą DESeq2, a następnie wyznaczono część wspólną z zestawem genów starzenia CellAge. Dane transkryptomiczne z kohorty TARGET-OS pobrano z bazy UCSC Xena. Geny kandydackie oceniono za pomocą jednowymiarowej regresji Coxa, analizy Kaplana-Meiera, analizy charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) zależnej od czasu, regresji Coxa LASSO, powtarzalnej analizy LASSO oraz modelowania mgaławki przeżycia (random survival forest), przy czym współzmienne kliniczne włączono do skorygowanych modeli Coxa. Do charakterystyki wykorzystano analizę wzbogacenia funkcjonalnego, analizę mikrośrodowiska immunologicznego, transkryptomikę jednokomórkową, transkryptomikę przestrzenną SP_BS3, walidację ekspresji w GSE36001 oraz walidację za pomocą qRT-PCR i Western blot w komórkach kostniaka 143B oraz komórkach osteoblastów. W GSE99671 zidentyfikowano 2 248 genów o różnicowej ekspresji przy skorygowanym P < 0,05, a ich część wspólna z 866 genami CellAge dała 105 różnicowo wyrażonych genów związanych ze starzeniem. W TARGET-OS niższa ekspresja PPARG była powiązana z wyższym ryzykiem śmiertelności (jednowymiarowe HR = 0,603, 95% CI = 0,454–0,802, P = 0,000494; skorygowane HR = 0,224, 95% CI = 0,085–0,589, P = 0,00241). Dodanie PPARG do modelu klinicznego zwiększyło wskaźnik C-index z 0,707 do 0,829. PPARG był obniżony zarówno w GSE99671, jak i w GSE36001, a qRT-PCR i Western blotting potwierdziły niższą ekspresję mRNA i białka PPARG w komórkach kostniaka 143B niż w komórkach osteoblastów. Analiza jednokomórkowa zlokalizowała PPARG w komórkach śródbłonka, perycytach, makrofagach/monocytach oraz w komórkach zrębu związanych z nowotworem. Analiza transkryptomiki przestrzennej wykazała słabe, ale istotne dodatnie korelacje między ekspresją PPARG a wskaźnikami starzenia CellAge, wskaźnikami związanymi ze śródbłonkiem oraz wskaźnikami związanymi z perycytami. Wyniki te wskazują na PPARG jako kandydata na biomarker prognostyczny pochodzący z CellAge, związany z niekorzystnym przeżyciem i cechami naczyniowego mikrośrodowiska w kostniaku złośliwym, oraz wspierają badanie jego potencjalnego znaczenia dla stratyfikacji ryzyka i mikrośrodowiska nowotworowego związanego ze starzeniem komórkowym. Zbiór GSE36001 posłużył wyłącznie do zewnętrznej walidacji ekspresji; nie przeprowadzono niezależnej walidacji przeżycia.
Kostniak osteogenny jest najczęstszym pierwotnym złośliwym nowotworem kości u dzieci, młodzieży i młodych dorosłych1. Chociaż wielolekowa chemioterapia w połączeniu z chirurgią poprawiła wyniki leczenia w przypadku choroby zlokalizowanej2,3, pacjenci z przerzutowym, nawracającym lub opornym na terapię kostniakiem osteogennym nadal wykazują niską przeżywalność długoterminową3,4. Pojawiające się dowody wskazują, że indukowane stresem oksydacyjnym przebudowanie epigenetyczne może ułatwiać adaptację przerzutową i progresję nowotworu, co podkreśla złożoną plastyczność molekularną leżącą u podstaw agresywnych fenotypów raka5. Niezawodne biomarkery, które byłyby jednocześnie interpretowalne klinicznie i informatywne biologicznie, pozostają nieliczne. Dlatego kluczowe pozostaje zidentyfikowanie cech molekularnych, które oddają heterogeniczność kostniaka osteogennego i ryzyko prognostyczne na wielu poziomach danych.
Starzenie się komórek (senescencja) to stabilny program zatrzymania cyklu komórkowego indukowany przez dysfunkcję telomerów, uszkodzenia DNA, stres oksydacyjny, aktywację onkogenów oraz presję terapeutyczną6. Senescencja może ograniczać aberracyjną proliferację; jednakże komórki senescentne mogą również przekształcać mikrośrodowisko guza poprzez programy zapalne, wydzielanie chemokin, czynników wzrostu oraz przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej7,8. W przypadku osteosarkoma geny związane z senescencją mogą odzwierciedlać zarówno wewnętrzne stany stresowe komórek nowotworowych, jak i niemaligniczne komponenty mikrośrodowiska, jednak ich znaczenie prognostyczne i organizacja przestrzenna nie zostały systematycznie ocenione.
PPARG koduje receptor gamma aktywowany przez proliferatory peroksysomów, który jest ligandowo aktywowanym receptorem jądrowym zaangażowanym w metabolizm lipidów, regulację zapalną, różnicowanie komórkowe oraz modulację odpornościową9. Rola PPARG w nowotworach zależy od kontekstu10. W niektórych przypadkach PPARG wiąże się z procesami różnicowania i stanami przeciwzapalnymi, podczas gdy w innych może wspierać adaptacyjne programy nowotworowe lub zrębowe. Niemniej jednak, wzorzec jego ekspresji, wartość prognostyczna oraz lokalizacja komórkowa i przestrzenna w kostniakomiaku nie zostały jeszcze w pełni scharakteryzowane.
W niniejszym badaniu zidentyfikowano geny o różnym poziomie ekspresji w zbiorze GSE99671, a następnie wyznaczono ich część wspólną z zestawem genów starzenia CellAge, co pozwoliło na wyłonienie 105 genów związanych ze starzeniem wykazujących różnicową ekspresję. Wykorzystując dane o przeżywalności z bazy TARGET-OS, wiele podejść opartych na uczeniu maszynowym i modelowaniu przeżywalności oraz korektę kliniczną, wskazano PPARG jako gen kluczowy. Dalsza charakterystyka PPARG została przeprowadzona przy użyciu analiz funkcjonalnych i mikrośrodowiska immunologicznego w badaniach bulk, transkryptomiki jednokomórkowej, transkryptomiki przestrzennej, zewnętrznej walidacji ekspresji z GSE36001 oraz walidacji metodą qRT-PCR i Western blot w linii komórkowej kostniakomięsaka 143B oraz w ludzkich osteoblastach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszym badaniu do analizy i walidacji wykorzystano publiczne zbiory danych oraz linie komórkowe; nie zaangażowano w nie uczestników będących ludźmi ani klinicznych próbek tkanek, w związku z czym zgoda komisji etycznej nie była wymagana.
Analiza różnicowej ekspresji w zbiorze GSE99671 i przecięcie z bazą CellAge
Surowe dane licznikowe (raw count data) oraz informacje o grupowaniu próbek dla GSE99671 pobrano z GEO11,12. Przeanalizowano osiemnaście par próbek z kostniakomięsaka i dopasowanych próbek prawidłowych. Analizę różnicowej ekspresji par przeprowadscono przy użyciu pakietu DESeq2 z formułą projektu ~ pair_id + condition, gdzie pair_id uwzględniał efekty parowania osobników, a condition porównywał tkankę nowotworową z tkanką prawidłową13. Zachowano geny, których liczba odczytów wynosiła co najmniej 10 w co najmniej trzech próbkach. Różnicową ekspresję zdefiniowano jako skorygowane P < 0,05, a do wizualizacji zastosowano bardziej rygorystyczny próg: skorygowane P < 0,05 oraz |log2FC| ≥ 1. Geny różnicowo eksponowane przecięto z listą 866 genów starzenia z bazy CellAge po konwersji symboli genów na wielkie litery14. Analizę różnicowej ekspresji przeprowadzono w środowisku R (wersja 4.3.2) z użyciem DESeq2 (wersja 1.40.2), a skorygowane wartości P obliczono metodą Benjamini-Hochberga.
Kohorta TARGET-OS i modelowanie prognostyczne
Transkrypcyjne i kliniczne dane z projektu TARGET-OS pozyskano z bazy UCSC Xena15. Wyekstrahowano wartości ekspresji dla 105 genów o różnej ekspresji związanych z procesem starzenia komórkowego. Uwzględniono osiemdziesięciu pięciu pacjentów z pełnymi danymi dotyczącymi czasu przeżycia, statusu przeżycia oraz ekspresji genów kandydackich, w tym 27 zdarzeń zgonu. Standaryzowane wartości ekspresji genów przeanalizowano za pomocą jednowymiarowej regresji Coxa16, analizy przeżycia Kaplana-Meiera oraz analizy charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) zależnej od czasu17. Do oceny stabilności wyboru i istotności zmiennych wykorzystano regresję Coxa metodą LASSO18, powtórną analizę stabilności LASSO oraz modelowanie za pomocą losowego lasu przeżycia (random survival forest)19. Zintegrowany wynik hub (hub score) oraz zintegrowany ranking kliniczny obliczono zgodnie z poniższymi jednoznacznymi kryteriami binarnymi. Analizy przeżycia przeprowadzono w środowisku R przy użyciu pakietów survival (wersja 3.5-7), timeROC (wersja 0.4), glmnet (wersja 4.1-8) oraz randomForestSRC (wersja 3.2.2). W przypadku jednowymiarowej analizy przesiewowej Coxa dla 105 genów kandydackich zastosowano korektę współczynnika odkryć fałszywych (FDR) według metody Benjamini-Hochberga; geny z FDR < 0.05 uznano za istotne statystycznie.
Preprocessing modelu, grupowanie PPARG i zależna od czasu analiza ROC
W grupie 85 pacjentów, wśród których odnotowano 27 zgonów, wykluczono geny o zerowej wariancji, brakujące wartości ekspresji genów kandydujących uzupełniono za pomocą imputacji medianą, a każdy gen kandydujący poddano standaryzacji z-score. Do analizy Kaplana-Meiera ekspresję zdychotomizowano na podstawie mediany kohorty: wartości ściśle powyżej mediany przypisano do grupy wysokiej ekspresji, a wartości równe lub poniżej mediany do grupy niskiej ekspresji (PPARG: n = 42 wysoka i n = 43 niska). Testy log-rank były dwustronne. W analizach ROC zależnych od czasu wykorzystano pakiet timeROC z parametrem event cause = 1, brzegowym ważeniem odwrotnością prawdopodobieństwa cenzurowania, czasami ewaluacji wynoszącymi 365, 1095 i 1825 dni oraz iid = FALSE. Aby zapewnić, że wyższe wartości markerów konsekwentnie wskazują na wyższe ryzyko, w przypadku genów z dodatnimi współczynnikami Coxa stosowano wystandaryzowane wartości ekspresji, natomiast dla genów ochronnych z ujemnymi współczynnikami wartości te mnożono przez -1.
LASSO i powtórzone LASSO
Model Cox LASSO dopasowano za pomocą pakietu glmnet, przyjmując family = "cox", alpha = 1, wcześniejszą standaryzację z-score (zatem standardize = FALSE), pięciokrotną walidację krzyżową, type.measure = "deviance" oraz losowy seed 123. Jako główne rozwiązanie współczynników wykorzystano lambda.min. Analiza stabilności polegała na 300-krotnym powtórzeniu tej samej pięciokrotnej walidacji krzyżowej; powtórzenie b wykorzystywało seed 1000 + b (b = 1,...,300). Dla każdego genu częstotliwość selekcji określono jako proporcję powtórzeń z niezerowym współczynnikiem przy lambda.min; odnotowano również niezerową selekcję przy lambda.1se.
Losowy las przeżycia
Las przeżycia dopasowano do wszystkich 105 znormalizowanych genów kandydujących przy użyciu randomForestSRC (wersja 3.2.2), stosując ziarno 123, ntree = 1,000, importance = TRUE oraz na.action = "na.impute". Dla danych przeżycia zachowano ustawienia domyślne pakietu: podział log-rank, mtry = 11 (sufiks pierwiastka kwadratowego z 105 predyktorów), minimalny rozmiar węzła końcowego = 15, nsplit = 10 losowych punktów podziału, próbkowanie bez zastawiania z frakcją próbkowania 0.632 oraz istotność zmiennych opartą na anti-split.
Zintegrowany wynik hubu
Każdy ze 105 kandydujących genów o zróżnicowanej ekspresji związanych z CellAge otrzymał jeden punkt za każde z sześciu kryteriów binarnych: (1) przynależność do części wspólnej zróżnicowanej ekspresji/CellAge (wszyscy kandydaci otrzymali ten punkt, ponieważ wymaganą wartość przed punktacją było skorygowane P < 0,05); (2) nominalne jednowymiarowe P Coxa < 0,05; (3) P testu log-rank Kaplan-Meier < 0,05; (4) średnie zależne od czasu AUC dla 3 i 5 lat ≥ 0,65; (5) częstotliwość wyboru lambda.min w powtarzalnym LASSO na poziomie 70. percentyla lub powyżej wśród kandydatów oraz > 0; oraz (6) istotność w random-survival-forest na poziomie 70. percentyla lub powyżej wśród kandydatów oraz > 0. Wszystkie kryteria miały taką samą wagę jednostkową, co dało wynik hubu od 0 do 6; geny z wynikiem ≥ 4 zakwalifikowały się do korekty klinicznej (18 genów). Raportowano również wartości FDR dla jednowymiarowego modelu Coxa, a FDR < 0,05 służyło do oznaczenia istotności przy wielokrotnym testowaniu, jednak wstępnie określony wskaźnik punktowy opierał się na nominalnym P < 0,05.
Ranking zintegrowany klinicznie
Po połączeniu danych o ekspresji i rekordów klinicznych, skorygowane analizy objęły 40 pacjentów z pełnymi zapisami współzmiennych oraz 13 zgonów. Końcowy wynik stanowił suma początkowego wyniku hub plus jeden punkt za każde z siedmiu kryteriów: skorygowane P Cox < 0,05, skorygowane P Cox < 0,10, czułe P Cox < 0,05 po usunięciu operacji radykalnej, czułe P Cox < 0,10, średnia AUC dla 3 i 5 lat ≥ 0,65, P testu ilorazu wiarygodności < 0,10 dla modelu klinicznego z genami w porównaniu z modelem tylko klinicznym oraz delta AIC < 0. Ponieważ progi 0,05 i 0,10 były zagnieżdżone, wartość P < 0,05 zapewniała dwa punkty, co nadawało większą wagę wyraźnie istotnym dowodom z analizy Coxa (skorygowanej i czułej). Całkowity zakres wyników wynosił od 0 do 13; remisy rozstrzygano na podstawie mniejszej wartości skorygowanego P Cox, a następnie większej średniej AUC dla 3/5 lat. PPARG otrzymał wszystkie sześć punktów początkowych oraz wszystkie siedem punktów z integracji klinicznej (13/13), zajmując pierwsze miejsce. Poprawa wskaźnika C-index została opisana opisowo i nie przypisano jej punktacji.
Korekta kliniczna
Kandydackie geny hub zostały zintegrowane ze zmiennymi klinicznymi z bazy TARGET-OS, w tym z płcią, wiekiem, stanem choroby w momencie diagnozy, miejscem wystąpienia guza pierwotnego, konkretnym regionem guza oraz operacją radykalną. Do analiz z korektą kliniczną włączono czterdziestu pacjentów z pełną dokumentacją ekspresji i danymi klinicznymi, w tym 13 zgonów. Modele Coxa zawierające wyłącznie zmienne kliniczne porównano z modelami uwzględniającymi zmienne kliniczne oraz ekspresję genów. Do oceny poprawy modelu wykorzystano wskaźnik C-index, kryterium informacyjne Akaike (AIC) oraz wartości P z testu ilorazu wiarygodności. Analizę wrażliwości przeprowadzono po usunięciu zmiennej dotyczącej operacji.
Analiza wzbogacenia funkcjonalnego i mikrośrodowiska odpornościowego
Próbki TARGET-OS zostały podzielone na warstwy zgodnie z ekspresją PPARG. Różnice w ekspresji między grupami PPARG-high a PPARG-low wykorzystano do wygenerowania rankingowych list genów do analizy wzbogacenia zbiorów genów (GSEA)20. Przedstawione ścieżki to: Nemeth Inflammatory Response LPS Up, Burton Adipogenesis 5, Burton Adipogenesis 6, Krieg KDM3A Targets Not Hypoxia, Reactome: Transcriptional Regulation By TP53, Fulcher Inflammatory Response Lectin Vs LPS Dn, Hollmann Apoptosis Via CD40 Dn, Zhou Inflammatory Response Live Dn, WP: Fatty Acids And Lipoproteins Transport In Hepatocytes, Sweet Lung Cancer KRAS Up, KEGG Medicus Pathogen HIV Tat To TLR2/4 NF-kB Signaling Pathway oraz Reactome: Fatty Acids. Obliczono całkowity wynik starzenia CellAge, a analizę korelacji Spearmana zastosowano do oceny powiązań między PPARG a genami starzenia lub sygnaturami mikrośrodowiska odpornościowego21. Różnice w wynikach mikrośrodowiska między grupami PPARG-high a PPARG-low oceniano za pomocą testów nieparametrycznych z korekcją na wielokrotne testowanie.
Analiza transkryptomiczna pojedynczych komórek
Opublikowany zestaw danych transkryptomicznych pojedynczych komórek z ludzkiego kostniakomięsaka przeanalizowano przy użyciu wstępnie przetworzonego obiektu, dla którego przeprowadzono już kontrolę jakości, redukcję wymiarowości, klasteryzację oraz adnotację ręczną22,23,24. Uwzględniono łącznie 68 336 komórek i 32 297 genów. Na potrzeby interpretacji tekstu głównego adnotacje uproszczono do 13 głównych typów komórek: limfocytów B, CAF, komórek w cyklu komórkowym, komórek śródbłonka, komórek erytroidalnych, makrofagów/monocytów, złośliwych komórek kostniakomięsaka, komórek miogennych, neutrofili, komórek podobnych do osteoklastów, perycytów, limfocytów T/NK oraz stromalnych komórek związanych z guzem. Do wizualizacji lokalizacji PPARG wykorzystano wykresy redukcji wymiarowości, ekspresji cech, wykresy kropkowe (dot plots) oraz skrzypcowe (violin plots). Komórki PPARG-dodatnie zdefiniowano jako komórki o ekspresji większej od zera. Różnice między typami komórek oceniano za pomocą testów Kruskala-Wallisa i Wilcoxona z korekcją Benjamini-Hochberga. Analizy pojedynczych komórek przeprowadzono w środowisku R z wykorzystaniem pakietu Seurat (wersja 5.0.1).
Analiza transkryptomiki przestrzennej
Próbkę transkryptomiki przestrzennej SP_BS3 wykorzystano do stworzenia obiektu ekspresji przestrzennej25,26. Progi kontroli jakości ustalono na poziomie nFeature_Spatial ≥ 200 oraz percent.mt ≤ 30, co pozwoliło na pozostawienie 4 572 spotów do analizy. Dane zostały znormalizowane, wyselekcjonowano 3 000 genów o wysokiej zmienności, a następnie przeprowadzono skalowanie danych, analizę głównych składowych, konstrukcję grafu sąsiedztwa, klastrowanie spotów przestrzennych oraz redukcję wymiarowości. Wynik starzenia przestrzennego (spatial CellAge senescence score) obliczono po usunięciu PPARG ze zbioru genów, aby uniknąć korelacji kołowej. Skonstruowano i oceniono sygnatury śródbłonka, perycytów, makrofagów/monocytów, stromy związanej z guzem, złośliwego osteosarcoma oraz komórek podobnych do osteoklastów. Do oceny powiązań między ekspresją PPARG a wynikami przestrzennymi wykorzystano analizę korelacji Spearmana. Przeniesienie etykiet (label transfer) wykonano, przyjmując zbiór danych z pojedynczych komórek jako referencyjny, a zbiór danych przestrzennych jako zapytanie, w celu wywnioskowania przewidywanych wyników typów komórek dla każdego spotu23,24. Analizy transkryptomiki przestrzennej przeprowadzono w środowisku R przy użyciu pakietu Seurat (wersja 5.0.1), a do wszystkich wartości P korelacji przestrzennych zastosowano korekcję FDR według metody Benjamini-Hochberga.
Zewnętrzna walidacja ekspresji w GSE36001
Zbiór danych GEO GSE36001 został wykorzystany wyłącznie jako niezależna kohorta walidacyjna ekspresji; ze względu na brak dostępnych danych dotyczących przeżywalności, nie został on użyty do walidacji prognostycznej11,27. Zbiór danych obejmował 19 próbek kostniakomięsaka oraz sześć normalnych próbek kontrolnych. Do konwersji identyfikatorów sond na symbole genów wykorzystano adnotacje platformy GPL6102. W przypadku przypisania wielu sond do tego samego genu, zachowano sondę o najwyższej średniej ekspresji. Różnicową ekspresję między grupą nowotworową a normalną oceniono za pomocą pakietu limma28. Analizy przeprowadzono w środowisku R z użyciem pakietu limma (wersja 3.56.2), a skorygowane wartości P obliczono metodą Benjamini-Hochberga.
Walidacja metodą qRT-PCR i Western blot
Walidację eksperymentalną przeprowadzono z wykorzystaniem ludzkiej linii komórkowej osteosarkoma 143B oraz ludzkich komórek osteoblastów. Komórki osteosarkoma hodowano w pożywce Dulbecco's modified Eagle's uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂, a pasażowanie wykonywano przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA przy 80%–90% konfluencji. Ludzkie komórki osteoblastów utrzymywano w zalecanych warunkach hodowli. Potwierdzono, że wszystkie linie komórkowe są wolne od zanieczyszczenia mycoplasma. Do analiz qRT-PCR całkowite RNA wyekstrahowano przy użyciu odczynnika do ekstrakcji RNA opartego na fenolu i guanidynium, a stężenie i czystość RNA oceniono spektrofotometrycznie. Jeden mikrogram całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu odczynnika do odwrotnej transkrypcji zgodnie z zalecanym protokołem. qRT-PCR przeprowadzono z wykorzystaniem chemii opartej na fluorescencyjnym barwniku wiążącym DNA w następujących warunkach cykliczności: wstępna denaturacja w 95 °C przez 30 s, a następnie 40 cykli w 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s, wraz z analizą krzywych topnienia w celu potwierdzenia specyficzności amplifikacji. Każda reakcję przeprowadzono w trzech powtórzeniach technicznych i wykonano trzy niezależne eksperymenty biologiczne. Jako kontrolę wewnętrzną zastosowano GAPDH, a względną ekspresję PPARG obliczono metodą 2-ΔΔCt29. Starter forward dla PPARG miał sekwencję 5'-CGAAGACATTCCATTCACAAGAACAG-3', a starter reverse 5'-AGATGCAGGCTCCACTTTGATTG-3'.
Wykonano analizę Western blotting w celu zbadania ekspresji białka PPARG. Komórki poddano lizie w buforze do radioimmunoprecypitacji uzupełnionym o inhibitory proteaz, a stężenia białek określono za pomocą testu z kwasem bicinchoninowym. Naniesiono równe ilości białka (30 µg (na ścieżkę) rozdzielono metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodatkiem 10% dodecylosiarczanu sodu, a następnie przeniesiono na membrany z difluorowodoru poliwinylydenu. Po blokowaniu 5% mlekiem beztłuszczowym przez 1 h w temperaturze pokojowej, membrany inkubowano przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko PPARG (1:1 000) i GAPDH (1:5 000), a następnie inkubowano z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (1:5 000) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Prążki białkowe wizualizowano za pomocą detekcji chemiluminescencyjnej; przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty. Intensywność prążków oznaczono ilościowo przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.30Różnice międzygrupowe analizowano przy użyciu obustronnego nieparzystego testu t Studenta t testy. Dane przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD) z trzech niezależnych eksperymentów oraz P < Przyjęto, że wartość 0,05 jest statystycznie istotna. Analizy statystyczne danych eksperymentalnych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej (wersja 9.0).
Analiza statystyczna
O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie analizy bioinformatyczne przeprowadzono w programie R (wersja 4.3.2). Za statystycznie istotne uznano dwustronne wartości P < 0,05. Korelacje oceniano przy użyciu współczynnika korelacji rang Spearmana (ρ). W stosownych przypadkach korektę dla wielokrotnych testów wykonano metodą FDR Benjamini-Hochberga. Dane eksperymentalne przedstawiono jako średnia ± SD i porównano za pomocą dwustronnych nieparzystych testów t Studenta. Eksperymentalne analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej (wersja 9.0).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zbiór GSE99671 zidentyfikował 105 genów związanych ze starzeniem komórkowym (CellAge) o różnym poziomie ekspresji
Zbiór GSE99671 obejmował 36 próbek z 18 par tkanek. Po odfiltrowaniu genów o niskiej liczbie odczytów zachowano 16 683 geny. Przy skorygowanym P < 0,05 stwierdzono różną ekspresję dla 2 248 genów. Przy zastosowaniu bardziej rygorystycznego progu skorygowanego P < 0,05 i |log2FC| ≥ 1, istotnych było 594 geny, w tym 102 geny o zwiększonej ekspresji i 492 geny o zmnie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszym badaniu, poprzez integrację analizy różnicowej ekspresji, przecięcia zbiorów genów CellAge, modelowania przeżywalności TARGET-OS, korekty klinicznej, lokalizacji multiomicznej oraz walidacji eksperymentalnej, wskazano PPARG jako potencjalny gen prognostyczny związany ze starzeniem komórkowym w kostniakomiaku. Przyjęte ramy analityczne były zgodne z obecnym naciskiem na badania nad kostniakomiakiem oparte na informacjach molekularnych oraz kuratorowanymi zasobami genów starzenia w celu interpretacji biologii ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy oświadczają, że nie istnieją żadne konflikty interesów.
WKŁAD AUTORÓW:
Yongwen Li i Wentao Qin opracowali koncepcję i zaprojektowali badanie. Yongwen Li przeprowadził analizy bioinformatyczne i obliczeniowe. Tuo Liang przeprowadził walidację eksperymentalną. Rubiao Qiu i Zide Zhang przyczynili się do przygotowania rycin. Rubiao Qiu i Zide Zhang nadzorowali badanie i krytycznie zrewidowali manuskrypt. Wszyscy autorzy zapoznali się z ostateczną wersją manuskryptu i ją zatwierdzili
Autorzy wyrażają wdzięczność badaczom i współtwórcom projektów GEO, TARGET-OS, UCSC Xena, CellAge, MSigDB oraz atlasu transkryptomicznego pojedynczych komórek i przestrzennego atlasu kostniakomięsaka ludzkiego za udostępnienie publicznie dostępnych zestawów danych i zasobów, które umożliwiły przeprowadzenie niniejszego badania. Praca ta była wspierana przez Guangxi Natural Science Foundation (nr 2023GXNSFAA026111).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało pierwszorzędowe anty-GAPDH | Proteintech Group, Wuhan, China | 10494-1-AP | Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wykrywania GAPDH jako kontroli załadunku w technice western blotting; rozcieńczenie 1:5,000. |
| Przeciwciało pierwszorzędowe anty-PPARG | Proteintech Group, Wuhan, China | 16643-1-AP | Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do wykrywania białka PPARG w technice western blotting; rozcieńczenie 1:1,000. |
| Zestaw do oznaczania białka BCA | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | PC0020 | Test kolorymetryczny stosowany do określania całkowitego stężenia białka przed elektroforezą. |
| DESeq2 | Bioconductor | Version 1.40.2 | Pakiet R stosowany do analizy różnicowej ekspresji genów w danych transkryptomicznych opartych na liczbie odczytów. |
| Podłoże DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | 11995 | Podstawowe podłoże hodowlane stosowane do utrzymania komórek osteosarkoma 143B. |
| Odczynnik do detekcji ECL | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | PE0010 | Substrat chemiluminescencyjny stosowany do wykrywania przeciwciał sprzężonych z HRP w technice western blotting. |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd. (Sijiqing), Huzhou, Zhejiang, China | 11011-8611 | Surowica dodawana do podłoża hodowlanego w celu wspierania wzrostu i żywotności komórek. |
| glmnet | CRAN | Version 4.1-8 | Pakiet R stosowany do analiz regresji z regularyzacją, w tym modelowania LASSO i elastic-net. |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | Version 9.0 | Oprogramowanie stosowane do analizy statystycznej, generowania wykresów i wizualizacji danych eksperymentalnych. |
| Sprzężone z HRP przeciwciało wtórne | Proteintech Group, Wuhan, China | SA00001-2 | Przeciwciało wtórne sprzężone z peroksydazą chrzanową stosowane do detekcji w western blot; rozcieńczenie 1:5,000. |
| Ludzkie komórki osteoblastów | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 406-05A | Pierwotne ludzkie komórki osteoblastów stosowane jako niezłośliwy typ komórek porównawczych/kontrolnych. |
| Ludzka linia komórkowa osteosarkoma 143B | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | CRL-8303 | Ludzka linia komórkowa osteosarkoma stosowana do eksperymentów walidacyjnych in vitro oraz analiz molekularnych. |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH), USA | Version 1.53 | Oprogramowanie do analizy obrazu stosowane do ilościowej analizy zdjęć eksperymentalnych. |
| limma | Bioconductor | Version 3.56.2 | Pakiet R stosowany do analizy różnicowej ekspresji i testowania statystycznego opartego na modelach liniowych. |
| Penicylina-streptomycyna | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | P1400 | Suplement antybiotykowy stosowany w podłożu hodowlanym w celu ograniczenia kontaminacji bakteryjnej. |
| Startery PPARG i GAPDH | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai, China | Custom synthesis; sequences provided in the Methods | Dedykowane startery oligonukleotydowe stosowane do analizy qPCR ekspresji PPARG i GAPDH. |
| Membrany PVDF, 0.45 µm | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | YA1701 | Membrany stosowane do transferu białek podczas western blotting. |
| Oprogramowanie statystyczne R | R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria | Version 4.3.2 | Środowisko obliczeń statystycznych stosowane do analiz bioinformatycznych, konstrukcji modeli i wizualizacji. |
| randomForestSRC | CRAN | Version 3.2.2 | Pakiet R stosowany do modelowania za pomocą random survival forest i analizy istotności cech. |
| Zestaw do odwrotnej transkrypcji | Beyotime Biotech Inc., Shanghai, China | D7168M | Stosowany do syntezy komplementarnego DNA (cDNA) z wyizolowanego RNA przed ilościowym PCR. |
| Bufor do lizy RIPA | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | R0010 | Bufor do ekstrakcji białek stosowany do lizy komórek w analizie western blot. |
| Seurat | Satija Laboratory | Version 5.0.1 | Pakiet R stosowany do przetwarzania, integracji, klastrowania i wizualizacji danych z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. |
| survival | CRAN | Version 3.5-7 | Pakiet R stosowany do analizy przeżywalności, w tym modelowania proporcjonalnych hazardów Coxa. |
| SYBR Green qPCR master mix | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | SR1110 | Fluorescencyjny master mix stosowany do ilościowej amplifikacji PCR w czasie rzeczywistym. |
| timeROC | CRAN | Version 0.4 | Pakiet R stosowany do generowania zależnych od czasu krzywych charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) i obliczania wydajności predykcyjnej w czasie. |
| Odczynnik TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15596026CN | Odczynnik stosowany do ekstrakcji całkowitego RNA z hodowli komórkowych. |
| Trypsyna-EDTA, 0.25% | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | T1300 | Odczynnik do dysocjacji komórek stosowany do pasażowania i zbierania komórek adherentnych. |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.