ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy wszystkim członkom laboratorium Dingal za ich rady, wiedzę specjalistyczną i dyskusje. Dziękujemy również UTD Flow Cytometry Core za infrastrukturę i wsparcie. M.B.L. jest wspierany przez UTD Eugene McDermott Graduate Fellowship. Badania te były wspierane przez UTD Startup Fund oraz granty National Institutes of Health-NIGMS dla laboratorium P.C.D.P.D. (R35GM150967).

Wszystkie eksperymenty z użyciem rekombinantowego S. cerevisiae przeprowadzono zgodnie z zasadami i procedurami Komitetu Biobezpieczeństwa Instytucjonalnego i Komitetu Bezpieczeństwa Chemicznego na Uniwersytecie Teksańskim w Dallas. Z rekombinantowymi szczepami drożdży postępowano zgodnie z wymogami poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1) zgodnie z ustalonymi instytucjonalnymi praktykami mikrobiologicznymi. Elektroporację, hodowlę i fluoresceinowo-aktywne sortowanie komórek (FACS) przeprowadzano zgodnie z zatwierdzonymi instytucjonalnymi procedurami bezpieczeństwa biologicznego. Kultury drożdży i zanieczyszczone materiały jednorazowego użytku dezaktywowano i usunięto jako odpady bioniebezpieczne zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
1. Przygotowanie wektora i wstawienia
<ol>
	<li>Generowanie bibliotek proteaz potywirusowych poprzez mutagenezę nasycającą miejsce
	<ol>
		<li>Projektowanie za pomocą oprogramowania do projektowania sekwencji, które nakładają się na oligonukleotydy do przodu i do tyłu o długości 30-50 merów, aby wygenerować mutantową bibliotekę proteaz. Zastąp kodon dziki w odpowiednim oligonukleotydzie degenerowanym kodonem NNS, gdzie N oznacza A, T, G lub C, a S oznacza G lub C, dla pozycji przeznaczonych do mutagenezy.</li>
		<li>Projektowanie nakładania 3′ między każdą parą oligonukleotydów do przodu i do tyłu o temperaturze topienia (Tm) 55-60 °C. Zaprojektuj pierwszy i ostatni oligonukleotyd tak, aby zawierały nakładanie 50 nt z wektorem wyświetlania na powierzchni drożdży poza miejscami restrykcyjnymi.</li>
		<li>Upewnij się, że przynajmniej jeden koniec wstawienia dokładnie nakłada się na jeden koniec zlinearyzowanego wektora, aby ułatwić rekombinację homologiczną13. Unikaj luk między sąsiednimi oligonukleotydami14.</li>
		<li>Resuspenduj oligonukleotydy do 100 µM z dejonizowaną wodą H2O. W sterylnym 1,5 mL probówce połącz 0,5 µL każdego oligonukleotydu do końcowej objętości 200 µL (końcowe stężenie 250 nM dla każdego oligonukleotydu).</li>
		<li>Skonfiguruj reakcję PCR z komponentami wymienionymi w Tabeli 1, aby skomponować bibliotekę proteaz, używając warunków termocyklowania w Tabeli 2.</li>
		<li>Skonfiguruj drugą reakcję PCR za pomocą zewnętrznych oligonukleotydów do przodu i do tyłu (Tabela 3), używając pierwszego złożonego produktu PCR jako szablonu. Zwiększ produkt jak pokazano w Tabeli 4.</li>
		<li>Uruchom drugi produkt PCR na żelu agarozy 1% z bromkiem etydyny (0,5 µg/mL) przy 240 V przez 30 min. Wyciąć pasmo odpowiadające oczekiwanej długości DNA. 
		UWAGA: UWAGA: Bromek etydyny jest mutagenem i należy z nim obchodzić się za pomocą odpowiedniego wyposażenia ochronnego (PPE), w tym płaszcza laboratoryjnego, rękawic nitrylowo-kauczukowych i okularów ochronnych. Unikaj kontaktu ze skórą i wdychania. Usuwaj żele, bufory i materiały jednorazowe zawierające bromek etydyny jako odpady chemiczne zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi bezpieczeństwa.</li>
		<li>Oczyść za pomocą zestawu do ekstrakcji z żelu. Eluuj w 50 µL dejonizowanej wody H2O.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Przechowuj DNA w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Każda 50 µL reakcja 2nd PCR da około 0,5-1,0 µg całkowitego DNA. Ponieważ każda elektroporacja wymaga 12 µg biblioteki proteaz (czyli wstawienia), skaluj odpowiednio reakcje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż kaset substratowych
	<ol>
		<li>Przygotuj płytki z agarem LB i płynne pożywki LB-chloramfenikolowe. Zobacz receptury w Tabeli 5.</li>
		<li>Zaprojektuj zestaw nakładających się oligonukleotydów o długości 30 merów w kierunku do przodu i do tyłu dla montażu kaset substratowych. Zaprojektuj 5′ końce każdego oligonukleotydu do tyłu i oligonukleotydu do przodu następnego fragmentu tak, aby pasowały przez 4 nukleotydy.</li>
		<li>Resuspenduj liofilizowano oligonukleotydy do 100 µM za pomocą dejonizowanej wody H2O.</li>
		<li>Wymieszaj reagenty jak w Tabeli 6.</li>
		<li>Użyj programu cyklowania w Tabeli 7 do analizy i fosforylowania mieszanki oligonukleotydów.</li>
		<li>Rozcieńcz analizowane oligonukleotydy 4-krotnie w dejonizowanej wodzie H2O, aby uzyskać końcowe stężenie 1,25 µM.</li>
		<li>Połącz analizowaną mieszankę oligonukleotydów z wektorem (np. pDD1523), zgodnie z Tabelą 8.</li>
		<li>Przeprowadź montaż Golden Gate, zgodnie z programem cyklowania w Tabeli 9. 
		UWAGA: Na przykład plazmid pDD1523 ma miejsce restrykcji typu IIS (BsmBI) poniżej promotora GAL1/10. Sukcesywny montaż umoż

<ol>
	<li>Adams MJ, Antoniw JF, Beaudoin F. Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Mol Plant Pathol. 2005;6:471&#8211;487.</li>
	<li>Lim Suan MB et al. Identification and engineering of highly functional potyviral proteases in cells using co-evolutionary models. Nat Commun. 2026;17:3257. doi: 10.1038/s41467-026-69961-5.</li>
	<li>Kapust RB, Waugh DS. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expr Purif. 2000;19:312&#8211;318.</li>
	<li>Nallamsetty S et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 2004;38:108&#8211;115.</li>
	<li>Chen Z, Elowitz MB. Programmable protein circuit design. Cell. 2021;184:2284&#8211;2301.</li>
	<li>Sanchez MI, Ting AY. Directed evolution improves the catalytic efficiency of TEV protease. Nat Methods. 2020;17:167&#8211;174.</li>
	<li>Denard CA et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 2021;10:63&#8211;71.</li>
	<li>Gietz RD, Schiestl RH. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2007;2:31&#8211;34.</li>
	<li>Benatuil L, Perez JM, Belk J, Hsieh CM. An improved yeast transformation method for the generation of very large human antibody libraries. Protein Eng Des Sel. 2010;23:155&#8211;159.</li>
	<li>Boder ET, Wittrup KD. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol. 1997;15:553&#8211;557.</li>
	<li>Lau WL et al. Using yeast surface display to engineer a soluble and crystallizable construct of hematopoietic progenitor kinase 1 (HPK1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Commun. 2021;77:22&#8211;28.</li>
	<li>Kieke MC et al. Selection of functional T cell receptor mutants from a yeast surface-display library. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96:5651&#8211;5656.</li>
	<li>Ma H, Kunes S, Schatz PJ, Botstein D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 1987;58:201&#8211;216.</li>
	<li>Varadarajan N, Cantor JR, Georgiou G, Iverson BL. Construction and flow cytometric screening of targeted enzyme libraries. Nat Protoc. 2009;4:893&#8211;901.</li>
	<li>Haas CM, Francino-Urdaniz IM, Steiner PJ, Whitehead TA. Identification of SARS-CoV-2 S RBD escape mutants using yeast screening and deep mutational scanning. STAR Protoc. 2021;2:100869. doi: 10.1016/j.xpro.2021.100869.</li>
	<li>Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 1983;153:163&#8211;168.</li>
	<li>Bloom JD, Arnold FH. In the light of directed evolution: pathways of adaptive protein evolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106:9995&#8211;10000.</li>
	<li>Yi L et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110:7229&#8211;7234.</li>
	<li>Martinusen SG et al. Modular and integrative activity reporters enhance biochemical studies in the yeast ER. Protein Eng Des Sel. 2024;37. doi: 10.1093/protein/gzae008.</li>
	<li>Li Q et al. Profiling protease specificity: combining yeast ER sequestration screening (YESS) with next generation sequencing. ACS Chem Biol. 2017;12:510&#8211;518.</li>
	<li>Packer MS, Rees HA, Liu DR. Phage-assisted continuous evolution of proteases with altered substrate specificity. Nat Commun. 2017;8:956. doi: 10.1038/s41467-017-01055-9.</li>
	<li>Yaghi RM, Andrews CL, Wylie DC, Iverson BL. High-resolution substrate specificity profiling of SARS-CoV-2 Mpro; comparison to SARS-CoV Mpro. ACS Chem Biol. 2024;19:1474&#8211;1483.</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów. Dane surowce wspierające ten protokół, w tym pliki FASTQ sekwencjonowania Nanopore, pliki cytometrii przepływowej (FCS) oraz dane źródłowe wykorzystane do generowania rysunków i tabel oraz plazmidy pDD1523 i pDD1524, zostały zdeponowane w Zenodo i są publicznie dostępne pod adresem 10.5281/zenodo.20746804

Ewolucja ukierunkowana to metoda wysoko-przepustowa, która wykorzystuje iteracyjne cykle dywersyfikacji i selekcji, aby zidentyfikować białka o zwiększonej lub nowej funkcji biochemicznej17. W tym protokole szczegółowo opisujemy zoptymalizowany przepływ pracy do ewolucji rozpoznawania proteazy-substrat za pomocą systemu prezentacji na powierzchni komórki w S. cerevisiae. System prezentacji na powierzchni komórki przypisuje aktywność proteazy do wykrywalnego fenotypu opartego na fluorescen...

Cysteinowe proteazy z rodziny Potyviridae, szczególnie proteazy inkluzji jądrowych A (NIa), stanowią w dużej mierze niewykorzystaną źródło sekwencjonowanych endopeptydaz. Z ponad 3800 scharakteryzowanych członków rodziny, proteazy NIa ciąć odrębną siedmioaminokwasową sekwencję substratu. Rodzina potywirusa oferuje zróżnicowane zestawy proteaz do inżynierii programowalnych systemów kontroli białek, budowy ortogonalnych obwodów genetycznych opartych na proteazach i opracowywania narzędzi biotechnologicznych o sekwencjonowanej specyficzności1,2. Mimo tej naturalnej różnorodności, tylko dwie proteazy NIa, TEVp i proteaza wirusa mozaiki żyłkowo-żyłkowej tytoniu (TVMVp), zostały dokładnie scharakteryzowane i opracowane do szerokiego zastosowania laboratoryjnego i biotechnologicznego3,4. Ten ograniczony zestaw proteaz ograniczony zakres projektowania dla wieloskładnikowych obwodów, które wymagają ortogonalnych aktywności proteaz5, motywując wysiłki na rzecz dalszej ekspansji i charakteryzacji proteaz NIa poprzez kierowaną ewolucję6,7.
Wyświetlanie na powierzchni drożdży stało się jedną z najpotężniejszych platform dla kierowanej ewolucji, umożliwiając przesiewowe badanie bibliotek białek o wysokiej wydajności za pomocą sortowania komórek aktywowanej fluorescencyjnie (FACS)6,7. Na przykład system sekwestracji w retikulum endoplazmatycznym drożdży (YESS) łączy aktywność proteazy z wyświetlaniem na powierzchni przez ścieżkę sekrecyjną S. cerevisiae6,7. System YESS został zastosowany do inżynierii nowych specyficzności proteazy-substratu i wykazał przydatność dla wieloraundowych kampanii kierowanej ewolucji. W tym systemie warianty proteaz są współekspresowane z białkiem fuzyjnym zawierającym kasetę substratu cięcia z markerami epitopu, a kotwica powierzchniowa Aga1p jest ekspresowana w szczepie drożdży EBY100. Różnicowe znakowanie fluorescującymi przeciwciałami odróżnia cięte od nieciętych kaset substratu wyświetlanych na powierzchni komórek. Ten mechanizm wyświetlania zależny od aktywności jest bezpośrednio zgodny z iteracyjną selekcją opartą na FACS dla bibliotek 107 lub więcej wariantów6,7.
Podstawowym warunkiem wstępnym kierowanej ewolucji jest zdolność do wprowadzania bibliotek wariantów w wystarczającej skali, aby osiągnąć adekwatne pokrycie docelowe przestrzeni sekwencji. Dla bibliotek mutagenezii sajt-saturacyjnej obejmujących wiele pozycji aminokwasowych, wydajności transformacji w wymiarze 108 do 109 unikalnych transformantów są potrzebne, aby upewnić się, że różnorodność wprowadzona do biblioteki jest dobrze reprezentowana w sortowanej populacji. Istnieje kilka metod wprowadzania egzogennego DNA do S. cerevisiae, każda z różnymi limitami przepustowości. Konwencjonalna metoda transformacji chemicznej używa acetylanu litu/pojedynczego łańcucha DNA nośnego/polietylenoglikolu (LiAc/ssDNA/PEG) ze względu na prostotę i dostępność. Jednak zazwyczaj osiąga wydajności transformacji tylko 104–106 jednostek tworzących kolonie (CFU) na mikrogram DNA, nie wystarczające dla wariacji sekwencji potrzebnej dla dużych kampanii bibliotek8. Natomiast metoda elektroporacyjna stosuje wysokonapięciowe pole elektryczne, aby przejściowo uporządkować błonę komórkową i ułatwić przyjęcie DNA. Elektroporacja osiąga spójnie najwyższe wydajności transformacji wśród dostępnych metod transformacji, przy czym zoptymalizowane protokoły raportują wydajności 108–109 CFU9. Zaobserwowano, że wydajność elektroporacji w S. cerevisiae jest krytycznie wrażliwa na fazę wzrostu komórki, masę DNA i skład buforu, zapewniając ramy, które od tego czasu zostały szeroko przystosowane do ewolucji kierowanej w skali bibliotek9.
Protokół opisany tutaj używa szczepu S. cerevisiae EBY100, szeroko przyjętego szczepu gospodarza dla wyświetlania na powierzchni drożdży. EBY100 został zaprojektowany przez Boder i Wittrup poprzez zintegrowanie kasety ekspresji AGA1 pod kontrolą galaktozo-indukowanego promotora GAL1 do chromosomowego locus AGA1 szczepu rodzicielskiej, niedeficiency protease BJ546510. Szczep jest komercyjnie dostępny od ATCC (numer katalogowy MYA-4941; depozyt K.D. Wittrup), nosząc genotyp MATa AGA1::GAL1-AGA1::URA3 ura3-52 trp1 leu2-Δ1 his3-Δ200 pep4::HIS3 prb1Δ1.6R can1 GAL (URA+, leu−, trp−). W rezultacie zarówno Aga1p, jak i fuzja kasety substratu Aga2p są ekspresowane z tego samego galaktozo-indukowanego promotora, upewniając, że dwie podjednostki są współindukuje i

<table><tbody><tr><td>Czynniki aktywne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>Reakcje PCR (Tabele 1, 3)</td></tr><tr><td>10X PBS, pH 7.4</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>Bufor podstawowy do barwienia (Kroki 3.2&ndash;3.3)</td></tr><tr><td>5X Q5 Reaction Buffer</td><td>NEB</td><td>B9027S</td><td>Sprzedane osobno; również dołączone do polimerazy Q5</td></tr><tr><td>Agar, Bacto</td><td>BD Difco</td><td>281230-500g</td><td>Płytki agar SDCAA (Tabela 5); 15 g/L</td></tr><tr><td>Agaroza (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Elektroforeza żelowa</td></tr><tr><td>Anti-FLAG PE Antibody</td><td>BioLegend</td><td>637309</td><td>Barwienie FACS; anty-FLAG połączone z PE</td></tr><tr><td>Anti-HA Tag Antibody [FITC]</td><td>GenScript</td><td>A01621</td><td>Barwienie FACS; anty-HA połączone z FITC</td></tr><tr><td>Bacto Casamino Acids</td><td>BD Difco</td><td>223120</td><td>Media SDCAA+, SGCAA+, SCAA (Tabela 5); 5 g/L</td></tr><tr><td>Bacto Peptone / Tryptone</td><td>RPI</td><td>T60060-10000.0</td><td>Przygotowanie mediów LB/SOB; 20 g/L w YPD (Tabela 5)</td></tr><tr><td>BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126575-10GM</td><td>0.5% w PBS; bufor do barwienia (Kroki 3.2&ndash;3.3)</td></tr><tr><td>BsmBI-v2 (200 U)</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td>Złote łączenie kasety substratowej (Tabela 8)</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku wapnia (1M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100mL</td><td>Bufor elektroporacyjny: 1 mM końcowe (Tabela 5)</td></tr><tr><td>Kolce do rolowania ColiRollers&reg;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71013-3</td><td>Sterilizuj, wkładając do butelek z reagentami i autoklawuj w 121&ordm;C, 15 psi, przez 15 min.</td></tr><tr><td>D-Galaktoza</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12813.30</td><td>250 g; 20% w/v stężenie dla indukcji SGCAA+ (Tabela 5)</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Thermo Fisher</td><td>1327300.10</td><td>Bufor elektroporacyjny (1 M) i media do wzrostu (Tabela 5)</td></tr><tr><td>Dekstroza (D-Glukoza), bezwonna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>YPD, SDCAA+, 20% w/v dekstryna (Tabela 5)</td></tr><tr><td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td><td>Sigma</td><td>Y0626-250G</td><td>6.7 g/L w SDCAA/SGCAA (Tabela 5)</td></tr><tr><td>Difco YPD Broth (wstępnie zmieszane)</td><td>BD</td><td>242820-500g</td><td>Gotowe alternatywa YPD; 500 g</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Bufor kondycjonujący: 10 mM końcowe; pobierz 250 &mu;L, przechowuj -20&deg;C</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6492-02</td><td>Oczyszczanie produktu PCR</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Gel Extraction Kit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D2500-01</td><td>Oczyszczanie żelu po PCR i reakcji restrykcyjnych (Kroki 1.1.8, 1.3.2)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6942-02</td><td>Oczyszczanie plazmidu (Krok 4.2)</td></tr><tr><td>Glicerol (&ge;99%)</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td>50% v/v stężenie dla szczepów glicerolowych (Krok 4.1.1)</td></tr><tr><td>Siarczan kanamacyny&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>SDCAA+ i SGCAA+: 50 &mu;g/mL końcowe; zastępuje Sigma K0879-5G</td></tr><tr><td>KLD Enzyme Mix</td><td>NEB</td><td>M0554S</td><td>Kinaza-Ligaza-DpnI; kierunkowa mutageneza</td></tr><tr><td>KLD Reaction Buffer</td><td>NEB</td><td>B0554A</td><td>Używany z KLD Enzyme Mix</td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td>Kultura ciekawa E. coli</td></tr><tr><td>Octan litu dihydrat (LiOAc&middot;2H2O)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A17921.30</td><td>Bufor kondycjonujący: 0.1 M końcowe; dodaj przed DTT (Tabela 5)</td></tr><tr><td>Luria Agar (Luria-Bertani Agar)</td><td>RPI</td><td>L24020-2000.0</td><td>Hodowla E. coli; zastępuje Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG</td></tr><tr><td>OmniPur Casamino Acids</td><td>Sigma</td><td>2240-500GM</td><td>Alternatywne źródło kwasów kasamino</td></tr><tr><td>pDD1523</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP</td></tr><tr><td>pDD1524</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS</td></tr><tr><td>Roztwór Penicyliny-Streptomycyny, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>SDCAA+, SGCAA+: 1X końcowe</td></tr><tr><td>PstI-HF (5000 U)</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td>Linearyzacja wektora (Tabela 10); używaj wersji HF</td></tr><tr><td>Q5 HF DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Wysoko-wiernościowa polimeraza; alternatywa dla Q5 Hot Start</td></tr><tr><td>Q5 High GC Enhancer</td><td>NEB</td><td>B9028A</td><td>Dla reakcji PCR z wysokim zawartością GC</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Składanie i amplifikowanie PCR (Tabele 1, 3)</td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer (10X)</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Dostarczany z

zoptymalizowany proces wyświetlania na powierzchni drożdży dla kierowane ewolucji proteaz

Optimized Yeast Surface Display Workflow for Directed Evolution of Proteases

Kierunkowa ewolucja naśladuje naturalny proces ewolucyjny w szybkim, kontrolowanym środowisku laboratoryjnym, aby opracować białka o pożądanych funkcjach lub cechach. Przesiewanie dużego zbioru mutantów kodujących białka pozwala na selekcję funkcjonalną pożądanych wariantów do zastosowań w biotechnologii, medycynie i biologii syntetycznej. Stosując ten protokół, przeprowadzamy kierunkowaną ewolucję w Saccharomyces cerevisiae, aby opracować warianty proteazy o wysokiej specyficzności dla obcego sekwencji substratu. Wyświetlamy te warianty proteazy na powierzchni komórki drożdży, aby ułatwić selekcję pożądanych wariantów za pomocą sortowania komórek z aktywacją fluorescencji (FACS) przez wiele rund wzbogacania. Cztery kluczowe elementy kasety substratowej są współwyrażane z biblioteką proteaz: białko fuzyjne składające się z (i) podjednostki receptora adhezji drożdży Aga2, (ii) sekwencji substratu do selekcji i (iii) przeciwnej selekcji, (iv) sekwencji tagów epitopowych oraz opcjonalnej sekwencji sygnałowej ponownego pobrania z siateczki endoplazmatycznej (ER). Komórki drożdży, w których tylko sekwencja substratu do selekcji jest rozcinana, są izolowany za pomocą wielobarwnego FACS za pomocą fluorescencyjnych (fitoerytryna/izotiocyjanian fluoresceiny–oznaczonych) przeciwciał przeciwko epitopom. Przedstawiamy szczegóły zoptymalizowanego, krok po kroku protokołu prowadzenia kampanii ewolucji proteazy, w tym projektowanie biblioteki wstawianych fragmentów DNA i projektowanie kasety substratowej, elektroporacja komórek drożdży z wysoką efektywnością transformacji (do 109 transformantów na mikrogram DNA), selekcja oparta na FACS, wzbogacanie i sekwencjonowanie zmutowanych wariantów. Demonstrujemy nasz protokół kierunkowanej ewolucji ewoluując proteazę nuklearnej inkluzji wirusa mozaiki tytoniu A (TEVp) z cięcia jej naturalnej sekwencji substratu, ENLYFQ↓S, do cięcia nowej sekwencji, ENLYFE↓S.

Efektywne tworzenie biblioteki jest kluczowe dla zapewnienia odpowiedniego pokrycia przestrzeni mutacyjnej. Aby uniknąć utraty rzadkich wariantów funkcjonalnych, liczba transformantów powinna osiągnąć co najmniej 10× do 100× teoretycznego rozmiaru biblioteki. Ponieważ wydajność transformacji w S. cerevisiae zależy od stężenia komórek i jest najwyższa w przypadku komórek we wczesnej lub środkowej fazie logarytmicznej wzrostu16, zoptymalizowano początkową gęstość komórek przed elektroporacj...

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną procedurę kierowanej ewolucji proteaz wirusowych w Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem systemu selekcji opartego na wyświetlaniu na powierzchni. Opisuje projektowanie biblioteki wstawianych fragmentów DNA oraz kaset substratowych, elektroporację zoptymalizowaną dla wysokiej efektywności transformacji, selekcję opartą na sortowaniu komórek z aktywacją fluorescencyjną dla rozszczepienia proteaz i sekwencjonowanie wzbogaconych wariantów.

Zoptymalizowany proces wyświetlania na powierzchni drożdży dla kierowane ewolucji proteaz

Directed evolution mimics the natural evolutionary process in a fast, controlled laboratory environment to evolve proteins with desirable functions or ...

optimized-yeast-surface-display-workflow-for-directed-evolution

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

Ten protokół opisuje podstawowe kroki do przeprowadzenia kampanii selekcji powierzchni drożdży w celu wzbogacenia wariantów białek wiążących się z interesującym nas antygenem.

Inżynieria białkowa za pomocą wyświetlacza powierzchni drożdży

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

Opracowano wszechstronną technikę litografii plazmowej do tworzenia stabilnych wzorów powierzchniowych służących do kierowania adhezją komórkową. Technika ta może być stosowana do tworzenia sieci komórkowych, w tym takich, które naśladują naturalne tkanki, i była wykorzystywana do badania kilku odrębnych typów komórek.

Wzornictwo powierzchni metodą litografii plazmowej do tworzenia sieci komórkowych

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Opisujemy tutaj działanie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia ciągłe i wysokorozdzielcze obrazowanie mikroskopowe pojedynczych pączkujących komórek drożdży podczas ich pełnego okresu replikacji i/lub chronologicznego życia.

Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Biokompatybilne nanoczujniki zol-żel reagujące na pH mogą być wbudowane w elektrowirowane rusztowania z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA). Wyprodukowane rusztowania samoraportujące mogą być wykorzystywane do monitorowania warunków mikrośrodowiskowych in situ podczas hodowli komórek na rusztowaniu. Jest to korzystne, ponieważ konstrukt komórkowy 3D może być monitorowany w czasie rzeczywistym bez zakłócania eksperymentu.

Rusztowania samoraportujące do trójwymiarowej hodowli komórkowej

Trójwymiarowa komora przepływowa to nowatorska technologia in vitro do ilościowej i stopniowej oceny kaskady wynaczynień komórek krążących w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego. W związku z tym urządzenie spełnia krytyczną potrzebę podstawowych, przedklinicznych i klinicznych badań migracji komórek.

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

The University of Texas at Dallas.  Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną procedurę kierowanej ewolucji proteaz wirusowych w Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem systemu selekcji opartego na wyświetlaniu na powierzchni. Opisuje projektowanie biblioteki wstawianych fragmentów DNA oraz kaset substratowych, elektroporację zoptymalizowaną dla wysokiej efektywności transformacji, selekcję opartą na sortowaniu komórek z aktywacją fluorescencyjną dla rozszczepienia proteaz i sekwencjono...

Zoptymalizowany proces wyświetlania na powierzchni drożdży dla kierowane ewolucji proteaz

Przeglądaj więcej filmów