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Artigo de investigação
* These authors contributed equally
Utilizando análises transcritômicas em larga escala, de célula única e espaciais, juntamente com modelagem de sobrevida baseada em aprendizado de máquina e validação experimental, este estudo indica o PPARG como um gene prognóstico candidato relacionado à senescência no osteossarcoma e associa sua expressão reduzida a um desfecho desfavorável na coorte TARGET-OS, bem como a características vasculares e do microambiente.
O osteossarcoma continua sendo um desafio nas formas metastáticas, recorrentes ou resistentes à terapia. Este estudo teve como objetivo identificar genes prognósticos relacionados à senescência e caracterizar seus contextos espaciais. Foi realizada uma análise diferencial de expressão emparelhada no conjunto de dados GSE99671 utilizando o DESeq2, seguida da intersecção com o conjunto de genes de senescência CellAge. Os dados transcriptômicos do cohort TARGET-OS foram obtidos do UCSC Xena. Os genes candidatos foram avaliados por meio de regressão de Cox univariada, análise de Kaplan-Meier, análise de característica operacional do receptor dependente do tempo, regressão de Cox com seleção por LASSO, análises repetidas de LASSO e modelagem por floresta de sobrevivência aleatória, com inclusão de covariáveis clínicas nos modelos de Cox ajustados. Realizaram-se enriquecimento funcional, análise do microambiente imunológico, transcriptômica de célula única, transcriptômica espacial SP_BS3, validação da expressão em GSE36001 e validação por qRT-PCR e Western blot em células de osteossarcoma 143B e células de osteoblastos para caracterizar o gene. No GSE99671, 2.248 genes apresentaram expressão diferencial com P ajustado < 0,05, e a intersecção destes com os 866 genes do CellAge resultou em 105 genes diferencialmente expressos relacionados à senescência. No TARGET-OS, a menor expressão de PPARG esteve associada a maior risco de mortalidade (HR univariada = 0,603, IC 95% = 0,454–0,802, P = 0,000494; HR ajustada = 0,224, IC 95% = 0,085–0,589, P = 0,00241). A inclusão de PPARG no modelo clínico aumentou o índice C de 0,707 para 0,829. PPARG foi subregulado tanto no GSE99671 quanto no GSE36001, e os ensaios de qRT-PCR e Western blot confirmaram menores níveis de expressão de mRNA e proteína de PPARG nas células de osteossarcoma 143B em comparação com as células de osteoblastos. A análise de célula única localizou PPARG em células endoteliais, pericitos, macrófagos/monócitos e células estromais associadas ao tumor. A análise transcriptômica espacial revelou correlações positivas fracas, mas significativas, entre a expressão de PPARG e os escores de senescência CellAge, bem como escores relacionados a células endoteliais e pericitos. Esses achados indicam PPARG como um biomarcador prognóstico candidato derivado do CellAge, associado à pior sobrevida e características do microambiente vascular no osteossarcoma, apoiando a investigação de sua possível relevância para a estratificação de risco e para o microambiente tumoral relacionado à senescência. O conjunto de dados GSE36001 forneceu apenas validação externa de expressão; não foi realizada validação independente de sobrevida.
O osteossarcoma é o tumor ósseo primário maligno mais comum em crianças, adolescentes e adultos jovens1. Embora a quimioterapia com múltiplos agentes combinada à cirurgia tenha melhorado os resultados para doenças localizadas2,3, pacientes com osteossarcoma metastático, recorrente ou resistente à terapia continuam a apresentar baixa sobrevida a longo prazo3,4. Evidências recentes indicam que a remodelação epigenética induzida pelo estresse oxidativo pode facilitar a adaptação metastática e a progressão tumoral, destacando a complexa plasticidade molecular subjacente aos fenótipos agressivos do câncer5. Biomarcadores robustos que sejam clinicamente interpretáveis e biologicamente informativos ainda são limitados. Portanto, identificar características moleculares que capturem a heterogeneidade do osteossarcoma e o risco prognóstico em múltiplas camadas de dados permanece importante.
A senescência celular é um programa estável de parada do ciclo celular induzido por disfunção dos telômeros, danos no DNA, estresse oxidativo, ativação de oncogenes e pressão terapêutica6. A senescência pode restringir a proliferação anormal; no entanto, células senescentes também podem remodelar o microambiente tumoral por meio de programas inflamatórios, de quimiocinas, de fatores de crescimento e de reestruturação da matriz extracelular7,8. No osteossarcoma, genes relacionados à senescência podem refletir tanto estados de estresse intrínsecos às células tumorais quanto compartimentos microambientais não malignos, ainda que sua relevância prognóstica e organização espacial não tenham sido sistematicamente avaliadas.
O gene PPARG codifica o receptor gama ativado por proliferadores de peroxissomos, um receptor nuclear ativado por ligante envolvido no metabolismo lipídico, regulação inflamatória, diferenciação celular e modulação imune9. O papel do PPARG no câncer é dependente do contexto10. Em alguns contextos, o PPARG está associado a estados de diferenciação e anti-inflamatórios, enquanto em outros pode apoiar programas tumorais ou estromais adaptativos. No entanto, seu padrão de expressão, valor prognóstico e localização celular e espacial no osteossarcoma ainda não são completamente caracterizados.
No presente estudo, genes diferencialmente expressos em GSE99671 foram identificados e intersectados com o conjunto de genes de senescência CellAge, resultando em 105 genes diferencialmente expressos relacionados à senescência. Em seguida, foram utilizados dados de sobrevida do TARGET-OS, múltiplas abordagens de aprendizado de máquina e modelagem de sobrevida, bem como ajuste clínico, para indicar PPARG como o gene central. PPARG foi posteriormente caracterizado por meio de análises funcionais e do microambiente imune em massa, transcriptômica de célula única, transcriptômica espacial, validação externa de expressão a partir de GSE36001 e validação por qRT-PCR e Western blot na linhagem celular de osteossarcoma 143B e em osteoblastos humanos.
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Este estudo utilizou conjuntos de dados públicos e linhagens celulares para análise e validação, e não envolveu participantes humanos ou amostras de tecidos clínicos; portanto, não foi necessária aprovação ética.
Análise de expressão diferencial na interseção de GSE99671 e CellAge
Os dados de contagem bruta e as informações de agrupamento de amostras para GSE99671 foram obtidos do GEO11,12. Dezoito pares de amostras de osteossarcoma e tecido normal correspondente foram analisados. A análise de expressão diferencial pareada foi realizada usando o DESeq2 com a fórmula de design ~ pair_id + condition, em que pair_id considerou os efeitos individuais pareados e condition comparou tecido tumoral com tecido normal13. Foram mantidos genes com contagens de leitura de pelo menos 10 em pelo menos três amostras. A expressão diferencial foi definida como P ajustado < 0,05, e um limiar mais rigoroso de P ajustado < 0,05 e |log2FC| ≥ 1 foi aplicado para fins de visualização. Os genes diferencialmente expressos foram intersectados com os 866 genes de senescência CellAge após a conversão dos símbolos gênicos para letras maiúsculas14. A análise de expressão diferencial foi realizada em R (versão 4.3.2) utilizando o pacote DESeq2 (versão 1.40.2), e os valores de P ajustados foram calculados pelo método de Benjamini-Hochberg.
Cohorte TARGET-OS e modelagem prognóstica
Os dados transcriptômicos e clínicos da coorte TARGET-OS foram obtidos do UCSC Xena15. Foram extraídos os valores de expressão dos 105 genes diferencialmente expressos relacionados ao envelhecimento celular. Oitenta e cinco pacientes com dados completos de tempo de sobrevida, status de sobrevida e expressão dos genes candidatos foram incluídos, com 27 eventos de morte. Os valores padronizados de expressão gênica foram analisados utilizando regressão de Cox univariada16, análise de sobrevida de Kaplan-Meier e análise de característica operacional do receptor dependente do tempo (ROC)17. A regressão de Cox com penalização LASSO18, análise de estabilidade LASSO repetida e modelagem por floresta aleatória de sobrevida foram utilizadas para avaliar a estabilidade da seleção e a importância das variáveis19. A pontuação integrada do gene central (hub score) e a classificação integrada clínica foram calculadas utilizando os critérios binários explícitos detalhados abaixo. As análises de sobrevida foram realizadas em R utilizando os pacotes survival (versão 3.5-7), timeROC (versão 0.4), glmnet (versão 4.1-8) e randomForestSRC (versão 3.2.2). Para a triagem univariada de Cox dos 105 genes candidatos, foi aplicada a correção da taxa de falsa descoberta (FDR) de Benjamini-Hochberg, e os genes com FDR < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
Pré-processamento do modelo, agrupamento do PPARG e análise ROC dependente do tempo
Entre 85 pacientes com 27 óbitos, genes com variância zero foram excluídos, valores ausentes de expressão dos genes candidatos foram imputados pela mediana e cada gene candidato foi padronizado pelo escore z. Para a análise de Kaplan-Meier, a expressão foi dicotomizada na mediana da coorte: valores estritamente acima da mediana foram atribuídos ao grupo de alta expressão e valores na mediana ou abaixo ao grupo de baixa expressão (PPARG: n = 42 alto e n = 43 baixo). Os testes log-rank foram bicaudais. As análises ROC dependentes do tempo utilizaram o pacote timeROC com causa do evento = 1, ponderação marginal inversa da probabilidade de censura, tempos de avaliação de 365, 1.095 e 1.825 dias e iid = FALSE. Para garantir que valores maiores do marcador indiquem consistentemente maior risco, foram utilizados valores padronizados de expressão para genes com coeficientes de Cox positivos e multiplicados por -1 para genes protetores com coeficientes negativos.
LASSO e LASSO repetido
O LASSO de Cox foi ajustado com glmnet usando family = "cox", alpha = 1, padronização prévia dos escores z (portanto, standardize = FALSE), validação cruzada de cinco dobras, type.measure = "deviance" e semente aleatória 123. A solução principal de coeficientes utilizou lambda.min. A análise de estabilidade repetiu a mesma validação cruzada de cinco dobras 300 vezes; a repetição b utilizou a semente 1000 + b (b = 1,...,300). Para cada gene, a frequência de seleção foi a proporção de repetições com coeficiente não nulo em lambda.min; também foi registrado o valor de seleção não nulo em lambda.1se.
Floresta de sobrevivência aleatória
Uma floresta de sobrevivência foi ajustada a todos os 105 genes candidatos padronizados com o pacote randomForestSRC (versão 3.2.2), utilizando a semente 123, ntree = 1.000, importance = TRUE e na.action = "na.impute". Os padrões do pacote para dados de sobrevivência foram mantidos: divisão por log-rank, mtry = 11 (teto da raiz quadrada de 105 preditores), tamanho mínimo do nó terminal = 15, nsplit = 10 pontos de divisão aleatórios, amostragem sem reposição com fração de amostragem de 0,632 e importância de variáveis com anti-split.
Pontuação integrada do hub
Cada um dos 105 genes candidatos diferencialmente expressos relacionados ao CellAge recebeu um ponto para cada um dos seis critérios binários: (1) pertencimento à interseção entre expressão diferencial e CellAge (todos os candidatos receberam este ponto, pois exigia-se P ajustado < 0,05 antes da pontuação); (2) P nominal univariado de Cox < 0,05; (3) P log-rank de Kaplan-Meier < 0,05; (4) média da AUC dependente do tempo de 3 e 5 anos ≥ 0,65; (5) frequência de seleção lambda.min no LASSO repetido igual ou acima do percentil 70 entre os candidatos e > 0; e (6) importância na floresta aleatória de sobrevida igual ou acima do percentil 70 entre os candidatos e > 0. Todos os critérios tinham peso unitário igual, resultando em uma pontuação do hub variando de 0 a 6; os genes com pontuação ≥ 4 avançaram para o ajuste clínico (18 genes). Os valores de FDR univariados de Cox também foram relatados, e FDR < 0,05 foi utilizado para indicar significância após correção para múltiplos testes, mas o indicador de pontuação pré-especificado utilizou P nominal < 0,05.
Classificação integrada clínica
Após a fusão dos dados de expressão e registros clínicos, as análises ajustadas incluíram 40 pacientes com registros completos de covariáveis e 13 óbitos. A pontuação final foi calculada somando a pontuação inicial de hub a um ponto para cada um dos sete critérios: valor de P ajustado de Cox < 0,05, valor de P ajustado de Cox < 0,10, valor de P de Cox de sensibilidade < 0,05 após remoção da cirurgia definitiva, valor de P de Cox de sensibilidade < 0,10, média da AUC de 3 e 5 anos ≥ 0,65, valor de P do teste da razão de verossimilhança < 0,10 para o modelo clínico-mais-gênico em comparação com o modelo somente clínico e delta AIC < 0. Como os limiares de 0,05 e 0,10 eram aninhados, um valor de P < 0,05 contribuía com dois pontos, conferindo, assim, maior peso às evidências ajustadas e de sensibilidade de Cox claramente significativas. A pontuação total variava de 0 a 13; empates foram resolvidos pelo menor valor de P ajustado de Cox, seguido pela maior média da AUC de 3/5 anos. O PPARG obteve todos os seis pontos iniciais e todos os sete pontos de integração clínica (13/13), ocupando o primeiro lugar. A melhoria no índice C foi relatada de forma descritiva e não recebeu pontuação.
Ajuste clínico
Os genes centrais candidatos foram integrados às variáveis clínicas do TARGET-OS, incluindo sexo, idade, estado da doença no diagnóstico, local primário do tumor, região tumoral específica e cirurgia definitiva. Quarenta pacientes com registros completos de expressão e dados clínicos, incluindo 13 óbitos, foram incluídos nas análises ajustadas clinicamente. Modelos de Cox contendo apenas variáveis clínicas foram comparados com modelos que incluíam variáveis clínicas mais a expressão gênica. Os valores de C-index, critério de informação de Akaike (AIC) e teste da razão de verossimilhança P foram utilizados para avaliar a melhoria do modelo. Uma análise de sensibilidade foi realizada após a remoção da variável cirurgia.
Enriquecimento funcional e análise do microambiente imune
As amostras do TARGET-OS foram estratificadas de acordo com a expressão de PPARG. A expressão diferencial entre os grupos PPARG-alto e PPARG-baixo foi utilizada para gerar listas ordenadas de genes para análise de enriquecimento de conjuntos de genes (GSEA)20. As vias exibidas foram: Resposta Inflamatória a LPS de Nemeth (cima), Adipogênese 5 de Burton, Adipogênese 6 de Burton, Alvos de KDM3A de Krieg não Hipóxia, Regulação Transcricional por TP53 do Reactome, Resposta Inflamatória a Lectina vs LPS de Fulcher (baixo), Apoptose via CD40 de Hollmann (baixo), Resposta Inflamatória a Vírus Vivo de Zhou (baixo), Transporte de Ácidos Graxos e Lipoproteínas em Hepatócitos do WP, Câncer de Pulmão KRAS (cima), Via de Sinalização HIV Tat para TLR2/4 NF-kB do KEGG Medicus e Ácidos Graxos do Reactome. Um escore de senescência bulk CellAge foi calculado, e a análise de correlação de Spearman foi utilizada para avaliar associações entre PPARG e genes de senescência ou assinaturas do microambiente imune21. As diferenças nos escores do microambiente entre os grupos PPARG-alto e PPARG-baixo foram avaliadas utilizando testes não paramétricos com correção para múltiplos testes.
Análise transcriptômica de célula única
Um conjunto de dados transcriptômicos de célula única de osteossarcoma humano publicado foi analisado utilizando um objeto pré-processado, para o qual controle de qualidade, redução de dimensionalidade, agrupamento e anotação manual já haviam sido concluídos22,23,24. Um total de 68.336 células e 32.297 genes foi incluído. Para interpretação no texto principal, as anotações foram simplificadas em 13 tipos principais de células: linfócitos B, CAFs, células em ciclo, células endoteliais, células eritróides, macrófagos/monócitos, células malignas de osteossarcoma, células miogênicas, neutrófilos, células semelhantes a osteoclastos, pericitos, linfócitos T/CN e células estromais associadas ao tumor. Redução de dimensionalidade, mapas de expressão de características, gráficos de pontos e gráficos de violino foram utilizados para visualizar a localização de PPARG. Células positivas para PPARG foram definidas como aquelas com expressão maior que zero. As diferenças entre os tipos celulares foram avaliadas utilizando os testes de Kruskal-Wallis e Wilcoxon com correção de Benjamini-Hochberg. As análises de célula única foram realizadas em R utilizando o pacote Seurat (versão 5.0.1).
Análise de transcriptômica espacial
A amostra de transcriptômica espacial SP_BS3 foi utilizada para construir um objeto de expressão espacial25,26. Os limiares de controle de qualidade foram nFeature_Spatial ≥ 200 e percent.mt ≤ 30, restando 4.572 pontos para análise. Os dados foram normalizados, 3.000 genes altamente variáveis foram selecionados, e foram realizadas a padronização dos dados, análise de componentes principais, construção do grafo de vizinhança, agrupamento espacial de pontos, e redução da dimensionalidade. Um escore espacial de senescência CellAge foi calculado após a remoção de PPARG do conjunto de genes para evitar correlação circular. Foram construídos e pontuados perfis de endoteliais, pericitos, macrófagos/monócitos, estromais associados ao tumor, osteossarcoma maligno e semelhantes a osteoclastos. A análise de correlação de Spearman foi utilizada para avaliar as associações entre a expressão de PPARG e os escores espaciais. A transferência de rótulos foi realizada utilizando o conjunto de dados de célula única como referência e o conjunto de dados espaciais como consulta, para inferir escores preditos de tipos celulares para cada ponto23,24. As análises de transcriptômica espacial foram realizadas em R utilizando o Seurat (versão 5.0.1), e a correção FDR de Benjamini-Hochberg foi aplicada a todos os valores de P de correlação espacial.
Validação externa de expressão em GSE36001
O conjunto de dados GEO GSE36001 foi utilizado exclusivamente como uma coorte independente para validação de expressão; como os desfechos de sobrevida não estavam disponíveis, ele não foi usado para validação prognóstica11,27. O conjunto de dados incluía 19 amostras de osteossarcoma e seis amostras normais de controle. A anotação da plataforma GPL6102 foi utilizada para converter identificadores de sondas em símbolos gênicos. Quando múltiplas sondas correspondiam ao mesmo gene, a sonda com a maior expressão média foi mantida. A expressão diferencial entre os grupos tumorais e normais foi avaliada usando o pacote limma28. As análises foram realizadas em R utilizando o limma (versão 3.56.2), e os valores de P ajustados foram calculados pelo método de Benjamini-Hochberg.
Validação por qRT-PCR e Western blot
A validação experimental foi realizada utilizando a linhagem celular de osteossarcoma humano 143B e células de osteoblastos humanos. As células de osteossarcoma foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 °C em atmosfera umidificada contendo 5% de CO₂, e subcultivadas com tripsina-EDTA 0,25% na confluência de 80%–90%. As células de osteoblastos humanos foram mantidas nas condições de cultivo recomendadas. Todas as linhagens celulares foram confirmadas como livres de contaminação por micoplasma. Para qRT-PCR, o RNA total foi extraído utilizando um reagente de extração de RNA baseado em fenol-guanidínio, e a concentração e pureza do RNA foram avaliadas espectrofotometricamente. Um micrograma de RNA total foi transcrito reversamente utilizando um reagente de transcrição reversa de acordo com o protocolo recomendado. A qRT-PCR foi realizada utilizando química baseada em corante fluorescente intercalante de DNA sob as seguintes condições de ciclagem: desnaturação inicial a 95 °C por 30 s, seguida por 40 ciclos a 95 °C por 5 s e 60 °C por 30 s, com análise de curva de dissociação para confirmar a especificidade da amplificação. Cada reação foi realizada em triplicata técnica, e três experimentos biológicos independentes foram conduzidos. O GAPDH foi utilizado como controle interno, e a expressão relativa de PPARG foi calculada pelo método 2-ΔΔCt29. O par de primers direto para PPARG foi 5'-CGAAGACATTCCATTCACAAGAACAG-3' e o inverso foi 5'-AGATGCAGGCTCCACTTTGATTG-3'.
A eletroforese em gel seguida de transferência para membrana (Western blotting) foi realizada para examinar a expressão da proteína PPARG. As células foram lisadas em tampão de radioimunoprecipitação suplementado com inibidores de protease, e as concentrações proteicas foram determinadas por meio de ensaio de ácido bicinconínico. Quantidades iguais de proteína (30 µg por poço) foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio a 10% e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno. Após o bloqueio com leite desnatado a 5% durante 1 h à temperatura ambiente, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra PPARG (1:1.000) e GAPDH (1:5.000), seguido pela incubação com um anticorpo secundário conjugado à peroxidase do rabo-de-cavalo (1:5.000) por 1 h à temperatura ambiente. As bandas proteicas foram visualizadas por detecção quimioluminescente, e três experimentos independentes foram realizados. As intensidades das bandas foram quantificadas utilizando software de análise de imagens30. As diferenças entre grupos foram analisadas utilizando o teste t de Student não pareado bicaudal t testes. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP) de três experimentos independentes, e P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As análises estatísticas dos dados experimentais foram realizadas utilizando software de análise estatística (versão 9,0).
Análise estatística
Salvo indicação em contrário, todas as análises bioinformáticas foram realizadas em R (versão 4.3.2). Valores de P bicaudais < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As correlações foram avaliadas utilizando o coeficiente de correlação de postos de Spearman (ρ). A correção para múltiplos testes foi realizada utilizando o método FDR de Benjamini-Hochberg, quando aplicável. Os dados experimentais foram apresentados como média ± DP e comparados utilizando testes t de Student não pareados bicaudais. As análises estatísticas experimentais foram realizadas utilizando software de análise estatística (versão 9,0).
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O GSE99671 identificou 105 genes diferencialmente expressos relacionados à senescência na lista CellAge
O GSE99671 incluiu 36 amostras de 18 tecidos pareados. Após a filtragem de contagens baixas, 16.683 genes foram mantidos. Com um valor de P ajustado < 0,05, 2.248 genes foram diferencialmente expressos. Sob o limiar mais rigoroso de P ajustado < 0,05 e |log2FC| ≥ 1, 594 genes foram significativos, incluindo 102 genes superexpressos e 492 genes subexpressos em tumores (
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Este estudo indicou PPARG como um gene candidato relacionado à senescência com valor prognóstico no osteossarcoma, integrando análise de expressão diferencial, interseção com genes do CellAge, modelagem de sobrevida no TARGET-OS, ajuste clínico, localização multi-ômica e validação experimental. Esse enfoque analítico foi coerente com a ênfase atual na pesquisa molecularmente orientada do osteossarcoma e nos recursos curados de genes relacionados à senescência para interpretação da biologia associada à senescência
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Os autores declaram não haver interesses conflitantes.
CONTRIBUIÇÃO DOS AUTORES:
Yongwen Li e Wentao Qin conceberam e planejaram o estudo. Yongwen Li realizou as análises bioinformáticas e computacionais. Tuo Liang realizou a validação experimental. Rubiao Qiu e Zide Zhang contribuíram na preparação das figuras. Rubiao Qiu e Zide Zhang supervisionaram o estudo e revisaram criticamente o manuscrito. Todos os autores revisaram e aprovaram o manuscrito final
Os autores agradecem com gratidão aos pesquisadores e colaboradores dos projetos GEO, TARGET-OS, UCSC Xena, CellAge, MSigDB e atlas transcriptômico de célula única e espacial do osteossarcoma humano pela disponibilização de conjuntos de dados e recursos publicamente acessíveis que permitiram este estudo. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Guangxi (nº 2023GXNSFAA026111).
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo primário anti-GAPDH | Proteintech Group, Wuhan, China | 10494-1-AP | Anticorpo primário utilizado para detectar GAPDH como controle de carga em blotagem ocidental; diluição 1:5.000. |
| Anticorpo primário anti-PPARG | Proteintech Group, Wuhan, China | 16643-1-AP | Anticorpo primário utilizado para detecção da proteína PPARG por meio de blotagem ocidental; diluição 1:1.000. |
| Kit de ensaio de proteína BCA | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | PC0020 | Ensaio colorimétrico utilizado para determinar a concentração total de proteína antes da eletroforese. |
| DESeq2 | Bioconductor | Version 1.40.2 | Pacote R utilizado para análise diferencial de expressão gênica de dados transcriptômicos baseados em contagem. |
| Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | 11995 | Meio de cultura basal utilizado para manutenção de células de osteossarcoma 143B. |
| Reagente de detecção ECL | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | PE0010 | Substrato quimioluminescente utilizado para detecção de anticorpos conjugados à HRP em blotagem ocidental. |
| Soro bovino fetal (FBS) | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd. (Sijiqing), Huzhou, Zhejiang, China | 11011-8611 | Suplemento sérico adicionado ao meio de cultura para suportar o crescimento e a viabilidade celular. |
| glmnet | CRAN | Version 4.1-8 | Pacote R utilizado para análises de regressão penalizada, incluindo modelagem LASSO e rede elástica. |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | Version 9.0 | Software utilizado para análise estatística, geração de gráficos e visualização de dados experimentais. |
| Anticorpo secundário conjugado à HRP | Proteintech Group, Wuhan, China | SA00001-2 | Anticorpo secundário conjugado à peroxidase de rábano-picante utilizado para detecção em blotagem ocidental; diluição 1:5.000. |
| Células de osteoblastos humanos | Cell Applications, Inc., San Diego, CA, USA | 406-05A | Células primárias de osteoblastos humanos utilizadas como tipo celular de comparação/controle não maligno. |
| Linhagem celular de osteossarcoma humano 143B | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | CRL-8303 | Linhagem celular de osteossarcoma humano utilizada para experimentos de validação in vitro e ensaios moleculares. |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH), USA | Version 1.53 | Software de análise de imagens utilizado para análise quantitativa de imagens experimentais. |
| limma | Bioconductor | Version 3.56.2 | Pacote R utilizado para análise de expressão diferencial e testes estatísticos baseados em modelos lineares. |
| Penicilina-estreptomicina | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | P1400 | Suplemento antibiótico utilizado no meio de cultura celular para reduzir contaminação bacteriana. |
| Primeres PPARG e GAPDH | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai, China | Síntese personalizada; sequências fornecidas nos Métodos | Primeres oligonucleotídicos personalizados utilizados para análise de qPCR da expressão de PPARG e GAPDH. |
| Membranas de PVDF, 0,45 µm | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | YA1701 | Membranas utilizadas para transferência de proteínas durante a blotagem ocidental. |
| Software estatístico R | R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria | Version 4.3.2 | Ambiente de computação estatística utilizado para análises bioinformáticas, construção de modelos e visualização. |
| randomForestSRC | CRAN | Version 3.2.2 | Pacote R utilizado para modelagem de floresta de sobrevivência aleatória e análise de importância de características. |
| Kit de transcrição reversa | Beyotime Biotech Inc., Shanghai, China | D7168M | Utilizado para síntese de DNA complementar (cDNA) a partir de RNA isolado antes da PCR quantitativa. |
| Tampão de lise RIPA | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | R0010 | Tampão de extração de proteínas utilizado para lisar células para análise por blotagem ocidental. |
| Seurat | Satija Laboratory | Version 5.0.1 | Pacote R utilizado para processamento, integração, agrupamento e visualização de dados de sequenciamento de RNA de célula única. |
| survival | CRAN | Version 3.5-7 | Pacote R utilizado para análise de sobrevivência, incluindo modelagem de riscos proporcionais de Cox. |
| Mistura mestra SYBR Green qPCR | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | SR1110 | Mistura mestra fluorescente utilizada para amplificação por PCR em tempo real quantitativa. |
| timeROC | CRAN | Version 0.4 | Pacote R utilizado para gerar curvas de característica operacional do receptor dependentes do tempo e calcular o desempenho preditivo ao longo do tempo. |
| Reagente TRIzol | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15596026CN | Reagente utilizado para extração de RNA total de células cultivadas. |
| Tripsina-EDTA, 0,25% | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China | T1300 | Reagente de dissociação celular utilizado para repicagem e coleta de células aderentes. |
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