Name: MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Aprenda o método de camada ultra fina para preparação de amostras em MALDI-MS, essencial para determinação precisa da massa de proteínas. Este protocolo demonstra técnicas de limpeza e aplicação da matriz.

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É muito importante usar luvas sem pó durante a preparação da camada fina. Limpeza da placa de amostra <ol><li> Use um aço inoxidável ou ouro placa amostra MALDI. </li><li> Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe. Não esfregue ou esfregar a superfície com o Kimwipe, para evitar arranhar a superfície. </li><li> Lavar com H 2 O e limpe delicadamente com um Kimwipe. </li><li> Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe. </li><li> Se necessário, repita MeOH / H 2 O ciclo de limpeza / MeOH, sempre terminando com MeOH. </li><li> Certifique-se que não há manchas fantasma ou resíduo restante no prato. Se houver manchas fantasma, lavar a placa com água deionizada, enquanto esfregando a superfície com a mão enluvada (Não esfregue com Kimwipes). Repita o MeOH / H 2 O ciclo de limpeza / MeOH. </li><li> Use a placa imediatamente após a lavagem. </li></ol> Preparação da solução fina camada de substrato <ol><li> Misture 1 parte de saturada 4 HCCA (2 partes ACN, 1 parte de água, e 0,1% TFA final) e 3 partes de isopropanol. Nota: A solução de substrato em camada fina é muito estável, e pode ser mantido em temperatura ambiente no escuro durante um ano. Também pode ser armazenado a 4 ° C. </li></ol> Fazendo a fina camada de substrato <ol><li> Aplicar 20 50μL da solução de camada fina de substrato sobre o centro-esquerda do prato, e espalhar com o lado de uma ponta da pipeta. Varredura em uma direção. </li><li> Como a seca solução, a evaporação do solvente orgânico muito rapidamente, deixando para trás gotas minúsculas de água na superfície da placa. Neste ponto, enrole seu dedo indicador com uma camada de Kimwipe e inicialmente suavemente blot a superfície da placa com ele. </li><li> Quando a superfície está livre de pingos de água, limpe toda a placa com uni-direcional movimentos arrebatadores usando um Kimwipe. Nota: Se a solução não se espalhe o suficiente ao longo da superfície da placa, o aumento da composição ACN e recriar a camada fina. Alguns parâmetros que podem afetar a propagação da solução incluem umidade do ambiente e da temperatura. Nota: Com placas de ouro, a camada geralmente aparece como um reflexo amarelado, dependendo da visão e ângulos de luz. Com chapas de aço, apenas a borda da camada é normalmente visível. </li><li> Limpe as bordas do prato com um Kimwipe fresco antes de o colocar no suporte da placa para evitar a contaminação da matriz de instrumento. </li></ol> Preparação da solução da matriz <ol><li> <a href="http://prowl.rockefeller.edu/protocols/saturated-4HCCA-solution.html">Saturado de 4 HCCA</a> em FWI (3 partes de ácido fórmico, 1 parte de água, 2 partes de isopropanol) é recomendada para análise de ambas as membranas e proteínas solúveis. Também pode ser usado em casos especiais para a análise de muito hidrofóbicas grandes peptídeos (M&gt; 4.000 u). Certifique-se que a solução matriz utilizada para detectar as proteínas não exceda ~ 50% de conteúdo orgânico, uma vez que irá dissolver completamente o substrato camada fina, derrotando as vantagens do método. </li></ol> Teste do substrato camada fina <ol><li> 0.5μL local da solução matriz na placa. Um precipitado esbranquiçado aparecerá na interface entre a camada fina ea gota. Quando esta camada cobre o fundo da gota inteiramente, geralmente dentro de 10-15 segundos, aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. Se demorar mais de 30 segundos para o precipitado para formar, é uma indicação de que pode haver um problema com o substrato em camada fina e / ou a solução matriz. </li></ol> Aplicação de exemplo <ol><li> A concentração do analito nas soluções de partida deve ser no prazo de 10 e 1000μM. </li><li> Diluir a solução do analito em solução de matriz para uma concentração de analito final entre 0,2 e 2μM. Por exemplo, comece com 1μl de amostra e 9μl de solução matriz. Nota: Certifique-se que a matriz está perto de ser saturada na solução final, caso contrário você vai dissolver o substrato em camada fina. Nota: As concentrações do analito necessária para obter sinais decente são altamente dependentes da complexidade da solução e composição (por exemplo, contaminantes) e ionizability analito. Nota: Se uma única etapa de diluição não produz bons resultados, você deve tentar mais um passo de diluição. Embora contra-intuitiva, as soluções de analito altamente concentrada raramente produzem espectros bom. Nota: as proteínas da membrana geralmente requerem diluições maiores. </li><li> 0.5μl ponto de amostra / matriz mistura no prato. Um precipitado esbranquiçado formarão na interface entre a camada fina ea gota. Este precipitado é o cocrystallization da matriz e do analito. Quando esta camada cobre o fundo da gota inteiramente, usualiado dentro de 10-15 segundos, aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. Se demorar mais de 30 segundos para o precipitado para formar, pode ser uma indicação de um contaminante presente, o que impede a cristalização, ou o seu analito é muito concentrado. </li></ol> Aplicação de calibração <ol><li> Prepare a mistura de calibração / matriz de uma forma semelhante, com uma concentração final de calibração entre 0,1-0.5μM. </li><li> Local 0.5μl mistura de calibração / matriz sobre a placa em estreita proximidade com os pontos da amostra. Esta proximidade física é usado em um procedimento de calibração pseudo-internas no qual a placa é movido a partir do ponto de amostra para o ponto de calibração durante a aquisição da amostra, para adicionar um disparos de laser alguns dos calibradores para o espectro. Esta abordagem garante uma calibragem maior precisão do que massa de calibração externo. </li></ol> Lavar passo <ol><li> Lave cada local, com aproximadamente 2μL de uma solução de TFA 0,1% gelada aquosa. Aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. </li></ol> Aquisição de espectros de massa <ol><li> Agora você está pronto para adquirir espectros de massa. Se você usar a solução matriz FWI, você deve adquirir o seu espectro o mais rapidamente possível para impedir a modificação irreversível ao analito, tais como formylation. </li></ol>

<ol><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Increase+Contaminant+Tolerance+in+Protein+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+by+the+Fabrication+of+Thin+Protein-Doped+Polycrystalline+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li>
<li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust%2C+Detergent-Friendly+Method+for+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Integral+Membrane+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins.</a> Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li>
<li>Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).</li>
</ol>

É fundamental que todos os reagentes são de alta qualidade (por exemplo, HPLC). Luvas sem pó (látex ou nitrilo) Aço inoxidável ou ouro placa amostra MALDI Metanol (MeOH) Água Kimwipes alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido (4-HCCA) Trifluoroacético ácido (TFA) (concentração final em 0,1% em H 2 O) Acetonitrila (ACN) Ácido fórmico Isopropanol

maldi preparação da amostra: o método de camada ultra thin

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS) 1, 2. O método de camada ultra-fina envolve a produção de uma camada de substrato de cristais de matriz (alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido) na placa de amostra, que serve como um campo de semeadura para a cristalização de uma mistura subseqüentes matriz / analito. Vantagens do método de camada ultra-fina sobre abordagens outra amostra de deposição (gotículas secas, por exemplo) são de que ele fornece (i) maior tolerância às impurezas tais como sais e detergentes, (ii) uma melhor resolução, e (iii) maior uniformidade espacial. Este método é especialmente útil para a determinação da massa exata de proteínas. O protocolo foi inicialmente desenvolvido e otimizado para a análise das proteínas da membrana e utilizado com sucesso para analisar os canais de íons, transportadores metabólito, e receptores, contendo entre 2 e 12 domínios transmembrana 2. Desde a publicação original, também tem mostrado ser igualmente útil para a análise de proteínas solúveis. Na verdade, nós tê-lo usado para um grande número de proteínas tendo uma vasta gama de propriedades, incluindo aqueles com massas moleculares tão alto quanto 380 kDa 3. Hoje é o nosso método de escolha para a análise de massa molecular de todas as proteínas. O procedimento descrito produz consistentemente de alta qualidade espectros, e é sensível, robusto e fácil de implementar.

Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS).

MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin

Este vídeo demonstra a preparação de uma camada ultrafina de matriz/analito para a análise de peptídeos e proteínas por Dessorção a Laser Assistida por Matriz...

Bem-vindo ao tutorial do laboratório CHI sobre o método da camada ultrafina, que é particularmente útil para a determinação precisa da massa de proteínas. Devido à natureza sensível da espectrometria de massas, utilizamos apenas reagentes de grau HPLC, bem como luvas de látex ou nitrílica sem pó para limpar a placa. Enxágue alternadamente com metanol e água, e finalmente novamente com metanol.Entre cada enxágue, remova suavemente o solvente em excesso usando papel para lentes. Você pode repetir essas etapas de lavagem quantas vezes forem necessárias para obter uma placa limpa. Após limpa e seca, a placa deve ser usada imediatamente.Aplique e espalhe de 20 a 30 microlitros de solução de substrato em camada fina sobre a placa MALDI limpa. Aqui, utilizamos uma ponteira P dois 50 para espalhar uniformemente a solução, evitando riscar a placa. Conforme a camada fina seca, remova quaisquer gotículas de água remanescentes, se presentes, pressionando suavemente com um lenço de papel kim.Em seguida, passe suavemente a placa com um movimento contínuo usando um lenço de papel Kim para formar adequadamente a camada fina. Por fim, limpe as bordas da placa para evitar contaminar o espectrômetro

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Farmacoterapia de reposição de dopamina uso de L-DOPA é o tratamento mais comumente utilizado sintomático da doença de Parkinson, mas é acompanhado por efeitos secundários, incluindo movimentos involuntários anormais, discinesia...

Espectrometria de Massa MALDI imagem de neuropeptídeos na Doença de Parkinson

Nós desenvolvemos uma tecnologia baseada na película fina de sílica mesoporosa para a recuperação selectiva de proteínas de baixo peso molecular e peptídeos a partir de soro humano. As propriedades físico-químicas dos nossos chips mesoporosos foram afinado para proporcionar um controle substancial no enriquecimento de peptídeo e, conseqüentemente, o perfil do proteoma de soro para fins de diagnóstico.

Enriquecimento protéico de baixo peso molecular em filmes finos de sílica mesoporosa para a descoberta de biomarcadores

Formalina de arquivo fixo e incluído em parafina (FFPE) amostras clínicas são material valioso para a investigação de doenças. Aqui demonstramos um fluxo de trabalho de preparação da amostra, permitindo uma análise em profundidade proteômica de tecido FFPE microdissecção.

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Medição de massa exata representa um passo importante durante a investigação de proteínas. De matriz assistida por laser de dessorção / ionização (MALDI) Espectrometria de massa (MS) pode ser utilizado para tal determinação e a sua principal vantagem é a tolerância para os sais, detergentes e contaminantes. Aqui, ilustramos uma abordagem acessível para a análise de proteínas maiores do que 100 kDa, por MALDI-MS.

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Uma fonte de imagem de espectrometria de massa (MSI) operada à pressão atmosférica foi desenvolvida acoplando dessorção a laser de infravermelho médio e pós-ionização por eletrospray. A matriz de gelo exógena foi usada como matriz de absorção de energia para facilitar a dessorção ressonante do material relacionado ao tecido. Este manuscrito fornece um protocolo passo a passo para a realização de IR-MALDESI MSI de camundongos neonatais de corpo inteiro.

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Um protocolo para reduzir as heterogeneidades espaciais dos sinais de iões em espectrometria de massa MALDI por regulação da temperatura do substrato durante o processo de secagem da amostra é demonstrada.

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Uma abordagem alternativa para preparação de amostras com baixo número de celular de Análise TEM

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O objetivo deste protocolo é fornecer orientação detalhada sobre a preparação adequada da amostra para análise lipídica e metabólito em pequenos tecidos, como o cérebro de Drosophila , utilizando imagens de espectrometria de massa a laser assistida por matriz(MALDI).

Preparação amostral para análise rápida lipídica no cérebro de Drosophila usando desorção a laser assistida por matriz/imagem de espectrometria de massa

Aprenda o método de camada ultra fina para preparação de amostras em MALDI-MS, essencial para determinação precisa da massa de proteínas. Este protocolo demonstra técnicas de limpeza e aplicação da matriz.

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