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Os autores agradecem o apoio fornecido pela Fundação da Escola da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu. Os autores agradecem o apoio concedido pela bolsa MPRC2022034. Esses recursos são utilizados para desenvolver um método de imagem dinâmica tridimensional para bactérias intestinais na Decocção Erchen no tratamento de camundongos obesos simples.

Este protocolo utiliza uma linhagem celular comercial (HT22, ATCC) e não envolve seres humanos ou tecidos humanos primários. Nenhum animal foi utilizado neste estudo.
1. Preparação padronizada de amostras
<ol>
	<li>Preparar células HT22
	<ol>
		<li>Quando a confluência das células HT22 atingir 80%10,11, descarte o meio antigo. Utilize tripsina a 0,25% para destacar as células, incubando por 1–2 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione o Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) em volume três vezes maior que o da tripsina a 0,25% para interromper o destacamento. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.</li>
		<li>Centrifugue a 175 x g durante 3 min à temperatura ambiente, depois descarte o sobrenadante. Re-suspenda as células em DMEM completo para criar uma suspensão de células individuais.</li>
		<li>Conte as células utilizando uma câmara de contagem. Plaque 5.000 células por poço em 100 µL de meio completo em uma placa de 96 poços12.</li>
		<li>Incube a placa a 37 °C com 5% de CO2 por 24 h. Realize o agrupamento das amostras, administração de tratamentos e coloração na placa de 96 poços conforme o delineamento experimental. 
		&#8203;NOTA: Utilize uma placa de 96 poços compatível com o sistema de imagem. Escolha uma placa com espessura e geometria de fundo adequadas, conforme as especificações do fabricante. Placas com fundo de vidro (espessura do fundo entre 130–170 µm) são recomendadas quando for necessária maior qualidade de imagem13,14,15,16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedimento de coloração
	<ol>
		<li>Assegure-se de que as células formem uma monocamada única e bem dispersa, sem exceder 70% de confluência, para minimizar a sobreposição celular (Figura 1B).</li>
		<li>Agrupe as amostras conforme os requisitos experimentais e prossiga com a coloração após o tratamento. Prepare as soluções de corante em trabalho com concentração final de 6,684 µg/mL para PI e 10 µg/mL para Hoechst 3334217,18.</li>
		<li>Descarte o meio antigo da placa de 96 poços e lave cada poço duas vezes com 100 µL de PBS. Adicione a solução de corante em trabalho e incube à temperatura ambiente, no escuro, por 30 min para coloração.</li>
		<li>Lave cada poço duas vezes com 100 µL de PBS, depois adicione DMEM. 
		NOTA: Diferentes delineamentos experimentais podem apresentar variações nos parâmetros de carregamento e coloração das amostras.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Especificações de imagem e configurações de parâmetros
<ol>
	<li>Padrões de parâmetros de imagem 
	&#8203;NOTA: Este estudo demonstra apenas o fluxo de trabalho de imagem em campo amplo para o instrumento após coloração com PI e Hoechst 33342.
	<ol>
		<li>Ligue o instrumento e, em seguida, inicie o computador. Abra o software de análise fornecido com o dispositivo.</li>
		<li>Carregue a placa de 96 poços no instrumento. Selecione o campo de visão com as amostras para aquisição de imagem.</li>
		<li>Nas configurações de Objetiva e Câmera, defina a Ampliação para &#34;20XPh1SPlanFluorELWDADM&#34; (Nikon, S Plan Fluor, ELWD, 20X/0.45, ∞/0-2, WD 8.2-6.9, OFN22, Ph1, AMD, MRH48230), binning da câmera para &#34;2&#34; e Modo de Aquisição para &#34;Widefield&#34;.</li>
		<li>No modo de placa, selecione os parâmetros correspondentes da placa de 96 poços e ajuste os parâmetros da placa de acordo com os dados de tamanho do produto.</li>
		<li>Na Opção de Sítio, selecione normalmente 9 campos por poço para imagem densa. Nas opções de Autofoco, selecione Habilitar focagem baseada em laser.</li>
		<li>Ajuste os parâmetros de autofoco a laser em Autofoco, com base na espessura média do fundo da placa medida em pelo menos três poços amostrais. Ajuste a espessura do fundo, variação máxima da espessura do fundo, variação máxima entre poços adjacentes, variação máxima intra-poco e variação máxima da placa conforme necessário.</li>
		<li>Em Comprimentos de Onda, defina o Número de comprimentos de onda para 3. Para a primeira Iluminação, selecione DAPI. Em Correção de Sombreamento, escolha &#34;Correção Automática para FL&#34; (Figura 2B).</li>
		<li>Após encontrar a imagem, defina a Exposição inicial (ms) para 20–30. Observe as imagens capturadas e ajuste continuamente a exposição para obter uma intensidade de fluorescência moderada sem superexposição, e defina a profundidade de bits para 16 (Figura 2A).</li>
		<li>Escolha Laser com deslocamento z para ajuste de foco. Se o foco não estiver nítido, marque Usar pilha Z, clique em Calcular Deslocamento e selecione uma distância focal apropriada. Marque Confocal Digital (info) e defina os parâmetros de ajuste para Aumentar Nitidez e Reduzir Ruído para 0,200. 
		NOTA: Se a exposição ou clareza da imagem não for satisfatória, ajuste a exposição e recalcule os parâmetros de deslocamento.</li>
		<li>Para a segunda Iluminação, selecione Cy3. Siga as mesmas configurações dos passos 2.1.7–2.1.9.</li>
		<li>Para a terceira Iluminação, selecione TL 25. Siga as mesmas configurações dos passos 2.1.7–2.1.9. 
		NOTA: Defina a correção de sombreamento com base no canal, e o canal TL 25 deve escolher Correção Automática para TL. Em Comprimentos de Onda, o canal TL deve ser configurado para posicionamento celular e observação morfológica.</li>
		<li>Na aba Executar, nomeie a placa de acordo com a convenção de nomenclatura: nome da placa-tipo celular-ID do experimento-data-ampliação da objetiva-tipo de imagem. Confirme os parâmetros relacionados ao canal de imagem em Descrição.</li>
		<li>Clique em Adquirir Placa para iniciar a aquisição de imagem. Após a conclusão da aquisição, desligue o software, o instrumento e o computador em sequência. 
		&#8203;NOTA: Posteriormente, o computador poderá ser ligado apenas para exportação de imagens, processamento de dados e análise de resultados.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Padrões e requisitos de operação de imagem
	<ol>
		<li>Centralize o campo de visão no poço para evitar efeitos de borda (Figura 1A). Durante a configuração dos parâmetros de imagem, use o controle positivo com maior intensidade de fluorescência como referência. Além disso, ao focar, escolha um campo de visão com uma única camada de células, limpo e livre de detritos.</li>
		<li>Para a câmera, controle rigorosamente os valores dos pixels abaixo de 60000 (o valor máximo é 65535) para evitar saturação, que pode causar perda permanente de informação. Se surgirem pontos ou áreas brilhantes saturados, reduza a exposição. Ao mesmo tempo, não mantenha o tempo de exposição muito baixo; caso contrário, o ruído dominará a imagem.</li>
		<li>Para sinais de fluorescência fracos, priorize um leve aumento da exposição em vez de elevar forçadamente os parâmetros, para evitar danos irreversíveis causados por fotodesvanecimento. 
		NOTA: Para imagens em campo claro, esses princípios podem ser apropriadamente relaxados, mas o foco principal permanece na integridade do sinal e na proteção da amostra.</li>
		<li>Garanta que os contornos das bordas da amostra sejam claramente distinguíveis e certifique-se de que as estruturas internas finas (como grânulos, fibras, organelas) apresentem texturas distintas, sem desfoque, e que a luz dispersa de fundo esteja uniformemente distribuída, sem pontos brilhantes locais ou halos desfocados. Evite rigorosamente super e subfocalização.</li>
		<li>Garanta a presença de grupos normais, positivos, negativos e experimentais, e que cada grupo de tratamento tenha pelo menos 3 poços paralelos. Recomenda-se organizar os poços paralelos verticalmente.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Processamento e análise de imagens
OBSERVAÇÃO: Este documento descreve três métodos de processamento de imagem fornecidos pelo software complementar do instrumento, todos adequados para o protocolo de coloração utilizado neste estudo. Embora esses métodos compartilhem o mesmo princípio subjacente de reconhecimento, diferem nas técnicas específicas de processamento e nos tipos de resultados de dados. O fluxo de trabalho de processamento de imagem foi o mesmo: Abrir o arquivo → Carregar a imagem original com o método de processamento correspondente → Definir os parâmetros adequados do canal → Gerar uma Máscara → Definir o tipo de dado de medição em Medir → Executar a análise → Observar os resultados → Exportar os dados.
<ol>
	<li>Abra o software de análise fornecido com o dispositivo → Revisar Placa → Selecionar Placa.</li>
	<li>Na visualização de data, selecione Arranjo de poços e escolha um campo de visão do grupo positivo como referência.</li>
	<li>Em Executar Análise, selecione o programa de processamento correspondente e defina os parâmetros de processamento de imagem ou exporte a imagem.</li>
	<li>Após definir e salvar os parâmetros, selecione Executar em todos os poços/Executar nas seleções/Executar no local exibido com base no objeto de configuração de parâmetros.</li>
	<li>Após o computador concluir o processamento dos dados, na aba Medidas, selecione o programa de processamento de dados correspondente em Análise e escolha diferentes resultados de medição em Medida para verificar os dados.</li>
	<li>Clique em Abrir Log para iniciar a exportação dos dados. Defina os seguintes detalhes nas configurações de parâmetros para os três métodos de processamento de imagem:
	<ol>
		<li>Método de processamento de imagem um: Pontuação Celular Multicomprimento de Onda
		<ol>
			<li>Selecione o programa Pontuação Celular Multicomprimento de Onda e configure as configurações. Defina o Número de comprimentos de onda. Escolha Padrão para o Algoritmo.</li>
			<li>Defina os parâmetros de reconhecimento para todos os núcleos com base nos resultados da coloração com PI. A imagem fonte padrão W1 é o canal DAPI.</li>
			<li>Defina a largura mínima aproximada para 8–10 µm e a largura máxima aproximada para 30–35 µm, com base no tamanho dos objetos individuais a serem reconhecidos.</li>
			<li>Defina a intensidade acima do fundo local para 2.000–10.000 níveis de cinza. Use Visualização para testar e ajustar as configurações com base nos resultados de reconhecimento.</li>
			<li>Defina os parâmetros W2 com base nos resultados da coloração com Hoechst 33342. Nomeie este canal. A imagem fonte W2 é Cy3.</li>
			<li>No campo Área colorida, selecione a região colorida por este canal como Núcleo. Siga as mesmas configurações dos passos 3.6.1.3–3.6.1.4 para as configurações subsequentes. Em Configurar Log de Resumo ou Configurar Log de Dados (Células), selecione a Configuração de Parâmetros correspondente com base nos parâmetros de resultado desejados. 
			NOTA: Normalmente, Configurar Log de Resumo é usado para definir os tipos de dados necessários, enquanto Configurar Log de Dados (Células) é usado quando for necessário marcar células individuais de forma específica.</li>
			<li>Realize uma Execução de Teste para observar o reconhecimento. Se os resultados de reconhecimento forem satisfatórios, salve as configurações.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Método de processamento de imagem dois: Viva-Morta
		<ol>
			<li>Selecione o programa Viva-Morta e comece a configurar as configurações. Defina sequencialmente os Parâmetros do Comprimento de Onda 1 e os Parâmetros do Comprimento de Onda 2.</li>
			<li>Em Parâmetros do Comprimento de Onda 1, defina a Fonte do Comprimento de Onda 1 como DAPI. O Algoritmo padrão é &#34;Padrão&#34;.</li>
			<li>Defina o tipo de célula colorida como Todas as Células e a área colorida como Núcleo com base nas condições de coloração. Defina largura mínima aproximada, largura máxima aproximada e intensidade acima do fundo local usando as mesmas configurações do método Pontuação Celular Multicomprimento de Onda.</li>
			<li>Marque Dividir objetos que se tocam e use Visualização para testar.</li>
			<li>Em Parâmetros do Comprimento de Onda 2, defina a Fonte do Comprimento de Onda 2 como Cy3.</li>
			<li>Defina o tipo de célula colorida como Morta e a área colorida como Núcleo com base na coloração específica. Defina largura mínima aproximada, largura máxima aproximada e intensidade acima do fundo local usando as mesmas configurações do método Pontuação Celular Multicomprimento de Onda.</li>
			<li>Clique em Configurar Log de Resumo e selecione a Configuração de Parâmetros com base nos tipos de dados necessários. Realize uma Execução de Teste para observar o reconhecimento. Se os resultados de reconhecimento forem satisfatórios, salve as configurações.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Método de processamento de imagem três: modo desenvolvedor CME
		<ol>
			<li>Selecione o programa Módulo Personalizado (CME) e comece a configurar as configurações. Configure Nomes de Imagem e canais. 
			NOTA: Para facilitar as configurações de parâmetros subsequentes, defina-os geralmente como os nomes dos canais usados durante a aquisição de imagens.</li>
			<li>Em Encontrar Objetos, abra Limiar Simples para definir o reconhecimento para todo o conjunto.</li>
			<li>Defina Fonte para corresponder ao Nome da Imagem. Com base na faixa de valores de escala de cinza de 16 bits, preencha 0 em Limiar Baixo e 65535 em Limiar Alto.</li>
			<li>Nomeie o resultado do processamento em Resultado, aplique e observe a situação de marcação. Em Encontrar Objetos, abra Encontrar Aglomerados para gerar um resultado de Máscara.</li>
			<li>Defina Fonte para corresponder ao Nome da Imagem, como em Limiar Simples. Defina largura mínima aproximada, largura máxima aproximada e intensidade acima do fundo local conforme as configurações do método Pontuação Celular Multicomprimento de Onda.</li>
			<li>Nomeie o resultado do processamento em Resultado, aplique e observe o resultado de marcação. Para o resultado de reconhecimento Encontrar Aglomerados, use a ferramenta Modificar Objetos para filtrar, expandir, contrair e inverter.</li>
			<li>Em Medir, defina Modificado. Em Entradas de Medição, insira 1 para Valor de Área Padrão e marque Criar Sobreposição de Objetos.</li>
			<li>Em Objetos para Medir, selecione a fonte dos objetos marcados em Máscara de Objetos e a imagem fonte a ser medida em Imagem para Medir. Escolha o Nome de Medição correspondente com base nos parâmetros do resultado de processamento necessários, aplique e observe o resultado de reconhecimento de parâmetros.</li>
			<li>Após confirmar as configurações de parâmetros, salve a configuração.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Método geral: ImageJ 
		&#8203;NOTA: Analise os resultados de imagem usando o método ImageJ para imagens fluorescentes19 e depois realize uma análise comparativa com os três métodos deste instrumento.
		<ol>
			<li>Abra o software ImageJ. Importação de Imagem: Arquivo → Abrir → Selecione a imagem original em escala de cinza a ser analisada.</li>
			<li>Converta a imagem para 8 bits: Imagem → Tipo → 8 bits. Reconhecimento de Valor de Escala de Cinza: Imagem → Ajustar → Limiar → Padrão, Vermelho → Marque Fundo escuro → Definir → OK. 
			NOTA: Se o reconhecimento da área vermelha for insatisfatório, substitua Padrão por um dos outros 16 modelos de reconhecimento embutidos no ImageJ ou ajuste o controle deslizante na caixa de diálogo.</li>
			<li>Defina Parâmetros: Analisar → Definir Medidas. Na caixa de diálogo pop-up, marque Área, Valor médio de cinza, Densidade integrada, Limitar ao limiar, Exibir rótulo, Redirecionar para Nenhum por padrão e insira 2 para Casas decimais (0-9). Clique em OK.</li>
			<li>Analise os Resultados de Reconhecimento: Analisar → Medir. Salve os Resultados: Na caixa de diálogo de resultados pop-up, Arquivo → Salvar Como e selecione o local de salvamento.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Exportação de imagem
	<ol>
		<li>Selecione um campo de visão de poço positivo de alta qualidade como padrão de referência. 
		NOTA: Os requisitos básicos de qualidade são autenticidade, foco preciso, exposição adequada (16 bits) e contraste apropriado (uma relação sinal-ruído mais alta é melhor). Os requisitos de alta qualidade incluem características distintas, contraste, praticidade, mudanças morfológicas intuitivas e pontos principais destacados.</li>
		<li>Em Executar Análise, selecione ExportPro na seção Análise e inicie Configuração de Execução para Análise. Em Selecionar opções de saída, escolha Canal individual, Sobreposição de cores, reduzir imagem (opcional) e Barra de escala (opcional) com base nos requisitos da imagem.</li>
		<li>Selecione as imagens dos canais fluorescentes a serem exportadas para cada campo de visão. Em Canal Individual, selecione uma cor para cada canal, como Azul para o canal DAPI e Monocromático para o canal TL.</li>
		<li>Em Sobreposição de cores, selecione os canais correspondentes a BRIGHTFIELD, VERMELHO, AZUL e VERDE em ordem (selecione o comprimento de onda da cor para sobreposição de cores). Defina o Número para 100; observe a imagem de visualização e aceite o resultado de visualização.</li>
		<li>Em saída, selecione a pasta onde as imagens exportadas serão armazenadas em Exportar para pasta. Inicie a execução. 
		NOTA: Imagens do mesmo lote não devem ser exportadas separadamente; um lote de imagens refere-se a um conjunto de imagens de quatro amostras principais: controle negativo, controle positivo, grupo controle básico e grupo experimental alvo, todas obtidas sob condições experimentais completamente consistentes.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Comparação dos métodos de processamento de imagem
	<ol>
		<li>Selecione 9 campos de visão e compare a contagem manual tradicional de células mortas e vivas com os métodos Pontuação Celular Multicomprimento de Onda, Viva-Morta, CME e ImageJ para contagem de células vivas, células mortas e a razão entre mortas e vivas. Use o GraphPad Prism versão 10.1 para realizar uma ANOVA unifatorial, acompanhada do teste de comparações múltiplas de Tukey, para analisar as diferenças.</li>
		<li>Selecione 81 campos de visão e compare as diferenças na contagem celular, área e intensidade entre os métodos Pontuação Celular Multicomprimento de Onda, Viva-Morta, CME e ImageJ. Use o GraphPad Prism versão 10.1 para realizar uma ANOVA unifatorial, acompanhada do teste de comparações múltiplas de Tukey, para analisar as diferenças. 
		NOTA: Os experimentos de cultura celular e coloração devem ser realizados dentro de uma cabine de segurança biológica. Descarte líquidos residuais, ponteiras e outros resíduos experimentais de acordo com as regulamentações do laboratório. Garanta proteção total durante todo o experimento.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

Todos os autores declaram que não há conflito de interesse. Durante a tradução do manuscrito, a Zhipu AI foi utilizada exclusivamente para tradução e não para gerar dados de pesquisa, resultados experimentais ou conteúdo acadêmico principal. Os autores assumem total responsabilidade pelo conteúdo do manuscrito.

Utilizando o método de dupla coloração com PI e Hoechst para determinar a viabilidade celular, por exemplo, o instrumento de alto conteúdo pode calcular rapidamente e de maneira de alto rendimento a viabilidade celular dentro do mesmo lote, usando módulos de algoritmos embutidos. Este método apresenta várias vantagens, incluindo baixo volume de amostra, baixo custo, dano celular mínimo, baixa fotodegradação da fluorescência, resistência ao apagamento e capacidade de capturar múltiplas imagens. Além disso, o tempo de aqui...

O Sistema de Imagem de Alto Conteúdo atua como uma ferramenta essencial na pesquisa científica moderna, permitindo a aquisição de imagens em alta velocidade e a avaliação multiparamétrica de células lesadas ou não lesadas1,2,3. Desempenha um papel insubstituível em diversas áreas do conhecimento. No campo das ciências da vida, auxilia os pesquisadores na exploração do mundo microscópico de células e tecidos4,5. Por exemplo, a detecção precisa de moléculas e estruturas marcadas com fluorescência dentro das células permite a visualização clara de estruturas celulares finas e mudanças dinâmicas6. Na pesquisa em neurociência, é capaz de realizar imagens tridimensionais de neurônios, auxiliando na análise das conexões complexas e dos mecanismos de transdução de sinais das redes neuronais, fornecendo pistas fundamentais para a compreensão das funções cerebrais e da patogênese de doenças neurológicas7,8,9.
Apesar das vantagens significativas da tecnologia de sistemas de imagem de alto conteúdo, vários problemas permanecem em seu processo de aquisição de imagens. Na etapa de preparação da amostra, há um alto grau de subjetividade. Na preparação de amostras biológicas, processos como o manuseio celular e a coloração carecem de padrões relevantes. Em termos de parâmetros de imagem, existem diferenças notáveis nos tempos de exposição e na seleção de placas de poços entre laboratórios e modelos de microscópios de alto conteúdo. Na fase de processamento de dados, há uma falta de padronização, desde a redução de ruído e o ajuste de contraste das imagens brutas até a identificação de parâmetros e a determinação de características-alvo. Esses problemas levam diretamente a vieses nos resultados de imagem microscópica, causando uma crise de reprodutibilidade.

<table><tbody><tr><td>Tubo Centrífugo de 1,5 mL</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>MCT-001-150</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta de 1000 &amp;micro;L</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>35423003E</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Centrífugo de 15 mL</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>CT-002-15A</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta de 2,5 &amp;micro;L</td><td>Qingdao Haier Biomedical Co., Ltd.</td><td>B10T</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta de 200 &amp;micro;L</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>T-001-200</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Centrífugo de 50 mL</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>CT-002-50A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultivo Celular de 96 Poços</td><td>Corning Incorporated</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de Canal Único Ajustável, 0,1&amp;ndash;2,5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf SE</td><td>3120000216</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de Canal Único Ajustável, 100&amp;ndash;1000 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf SE</td><td>3120000267</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de Canal Único Ajustável, 20&amp;ndash;200 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf SE</td><td>3120000259</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de Canal Único Ajustável, 2&amp;ndash;20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf SE</td><td>3120000232</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a name=&quot;RANGE!A13"&gt;Placa de Cultivo Celular&lt;/a&gt;</td><td>Corning Incorporated</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Frascos Criogênicos</td><td>Labigic Technology Co., Ltd.</td><td>BS-20-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dissulfóxido de dimetila (DMSO)</td><td>Beijing Solarbio Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Life Technologies Limited</td><td>11966-025</td><td>Neste estudo, o DMEM completo foi preparado utilizando 10% de SBF, 1% de Solução de Penicilina-Estretomicina e 89% de DMEM.</td></tr><tr><td>Incubadora CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; ESCO CelCulture</td><td>Esco Micro Pte. Ltd.</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal (SBF, Superfine)</td><td>Procell Life Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>164210-50</td><td></td></tr><tr><td>Cores Fluorescentes Hoechst 33342</td><td>Beijing Solarbio Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>B8040</td><td></td></tr><tr><td>Célula HT22</td><td>Procell Life Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>CL-0697</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>O ImageJ é um dos softwares de processamento de imagens utilizados no manuscrito.</td></tr><tr><td>Sistema de Imagem de Alta Capacidade com Microscopia Confocal ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td>ImageXpress Micro Confocal</td><td>No manuscrito, utilize "Sistema de Imagem de Alta Capacidade" como substituto do nome do instrumento.</td></tr><tr><td>Centrífuga de congelamento de baixa velocidade</td><td>Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.</td><td>L530R</td><td></td></tr><tr><td>Software de Aquisição e Análise de Imagem de Alta Capacidade MetaXpress</td><td>Molecular Devices, LLC</td><td></td><td>O software é um complemento ao Sistema de Imagem de Alta Capacidade com Microscopia Confocal ImageXpress&amp;reg;. No manuscrito, "O software de análise fornecido com o equipamento" refere-se a este software.</td></tr><tr><td>Capa de Fluxo Laminar Vertical OptiMair</td><td>Esco Micro Pte. Ltd.</td><td>ACB-4E1</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Pechiney Plastic Packaging Inc.</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>&amp;nbsp;Shanghai Yuchun biology science and technology co., ltd&amp;nbsp;</td><td>YC-5013</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estretomicina</td><td>Procell Life Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>PB180120</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Iodeto de Propídio (PI)</td><td>Beijing Solarbio Science &amp; Technology Co., Ltd.</td><td>C0080</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Tripsina-EDTA</td><td>BasalMedia Technology Co., Ltd.</td><td>S310KJ</td><td></td></tr></tbody></table>

fluxo de trabalho padronizado para imagem de alto conteúdo e processamento de dados

Standardized Workflow for High-Content Imaging and Data Processing

Para enfrentar os desafios da baixa reprodutibilidade decorrentes de variações operacionais em imagens na pesquisa científica e da complexidade na análise de um grande número de amostras por métodos convencionais, apresentamos um protocolo para coloração de células HT22 com PI e Hoechst 33342, seguido de aquisição de imagens e análise dos dados utilizando o Sistema de Imagem de Alto Conteúdo. Este fluxo de trabalho tem como objetivo estabelecer parâmetros robustos de configuração de imagem e padrões rigorosos de controle de qualidade. Ele demonstra as configurações de imagem do equipamento e o fluxo de trabalho para três métodos diferentes de processamento de imagem fornecidos pelo instrumento: Pontuação Celular Multicomprimento de Onda (Multi), Vivas-Mortas (Live) e Editor de Módulo Personalizado (CME). Os métodos de processamento de imagem são comparados e validados frente ao método tradicional, ImageJ, para garantir sua eficácia. O estudo conclui com um resumo do fluxo de trabalho para utilização do Sistema de Imagem de Alto Conteúdo na determinação da viabilidade celular pelo método de dupla coloração com PI e Hoechst. Ao padronizar todo o fluxo de trabalho de aquisição de imagens e processamento de dados, o estudo aumenta significativamente a reprodutibilidade e a confiabilidade das imagens em pesquisa científica, fornecendo assim suporte metodológico sólido para comparação de dados entre laboratórios e avançando a pesquisa científica.

Impacto da preparação padronizada na qualidade da imagem
Os parâmetros da placa foram configurados para garantir que o instrumento pudesse localizar com confiabilidade a camada de imagem das células. Amostras preparadas em uma única camada de células com confluência moderada facilitaram o foco da imagem em diferentes aumentos do objetivo e melhoraram o reconhecimento da imagem e a análise quantitativa. O preparo padronizado das amostras e os parâmetros otimizados da placa mini...

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem de alto conteúdo padronizada e processamento de dados de células coradas com iodeto de propídio (PI)/Hoechst 33342 para realizar análises reprodutíveis de viabilidade celular utilizando fluxos de trabalho automatizados de aquisição e análise de imagens.

Fluxo de Trabalho Padronizado para Imagem de Alto Conteúdo e Processamento de Dados

Para enfrentar os desafios da baixa reprodutibilidade decorrente de variações operacionais no imageamento de pesquisa científica e a complexidade de analisar um grande...

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Research

JoVE Journal

Biology

Um método de rastreio de alto conteúdo para a identificação de novos receptores de sinalização transmembrana competentes é descrito. Este método é passível de automatização em larga escala e permite previsões...

Um fluxo de trabalho de imagem de alta de conteúdo para estudar Grb2 Complexos de Sinalização por clonagem de expressão

Apresentado é um informática fluxo de trabalho flexível permitindo uma análise baseada em imagem multiplexado de células marcadas com fluorescência. O fluxo de trabalho quantifica marcadores nucleares e citoplasmáticos e calcula marcador translocação entre esses compartimentos. Os procedimentos são fornecidos por perturbação das células utilizando metodologia de siRNA e fiável para a detecção do marcador através de imunofluorescência indirecta em formatos de 96 poços.

Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

Estudar o microambiente do tumor pode identificar biomarcadores prognósticos ou preditivos de resposta clínica à imunoterapia. Apresentado aqui, é um método inovador baseado em situ fluorescência multiespectral de imagens para analisar e contar automaticamente várias subpopulações de CD8+ T células. Esta técnica reprodutível e confiável é apropriada para análises de grandes coorte.

Multiplexado imunofluorescência análise e quantificação de Intratumoral PD-1+ + Tim-3 CD8+ T células

Aqui descrevemos um protocolo para a segmentação automática de tecidos fluorescente etiquetadas em slides utilizando um sistema de análise de alto teor widefield (WHCAS). Este protocolo tem aplicações abrangentes em qualquer campo que envolve a quantificação de marcadores fluorescentes em tecidos biológicos, incluindo as ciências biológicas, engenharia médica e Ciências da saúde.

Digitalização de slides automatizado e segmentação em tecidos fluorescente-rotulado, usando um sistema de análise de Widefield alto teor

Mapas crio-EM de alta resolução de macromoléculas também podem ser alcançados usando microscópios TEM de 200 kV. Este protocolo mostra as melhores práticas para definir alinhamentos ópticos precisos, esquemas de aquisição de dados e seleção de áreas de imagem que são essenciais para a coleta bem-sucedida de conjuntos de dados de alta resolução usando um TEM de 200 kV.

Coleta rotineira de conjuntos de dados crio-EM de alta resolução usando microscópio eletrônico de transmissão de 200 KV

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de alto rendimento para segmentação de regiões de interesse confirmadas pela patologia de imagens de seção de tecidos manchados e finos para enriquecimento de populações celulares resolvidas por histologia usando microdisseção a laser. Esta estratégia inclui um novo algoritmo que permite a transferência de demarcações denotando populações celulares de interesse diretamente para microscópios a laser.

Microdisseção laser industrializada e guiada por inteligência artificial para análise proteômica microescalada do Microambiente tumoral

A combinação de multiplexidade iterativa de branqueamento (IBEX) e um ensaio comercial de marcação de nucleotídeos (Click-iT EdU) permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão em processos altamente dinâmicos em seções fixas de tecido murino congelado. Além disso, um novo pipeline de processamento de imagens de código aberto fornece aquisição e análise de imagens de alto rendimento.

Fluxo de trabalho de imagem e análise de alto rendimento para avaliar fenótipos de células da pele e estados de proliferação em amostras de tecido

Este artigo descreve métodos passo a passo para automatizar a quantificação de núcleos baseada em imagem usando um programa executável de código aberto validado em uma variedade de densidades de células. Este programa fornece uma alternativa que aborda as barreiras relacionadas ao custo, acessibilidade para usuários com habilidades tecnológicas limitadas e validação específica do aplicativo que pode limitar a utilidade das tecnologias existentes.

Usando bibliotecas de visão computacional para simplificar a quantificação de núcleos

A implementação de uma técnica de fotoirradiação versátil e de baixo custo com o método IBEX manual permite imagens ideais de tecido humano com autofluorescência nativa significativa. Este protocolo detalha como obter imagens multiplexadas de lâminas inteiras de amostras clínicas arquivadas usando um microscópio invertido, reagentes amplamente disponíveis e software de código aberto para alinhamento e processamento de imagens.

Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

O Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) baseia-se na técnica básica do IBEX, adicionando bloqueio de heparina para minimizar a ligação inespecífica e aproveitando a detecção espectral com desmistura computacional para suprimir a autofluorescência. Essa abordagem acelera a aquisição de imagens enquanto reduz as fontes de fundo, permitindo análises proteômicas espaciais robustas de várias rodadas e de alto parâmetro.

Imagens de alta plexidade usando microscopia confocal espectral para minimizar a fluorescência de tecido não específico

O fluxo de trabalho de citomorfologia digital automatizada do sangue periférico e da medula óssea é descrito. Após preparação padronizada da esfregação e coloração, um scanner captura imagens de amostras. Softwares com IA localizam, registram e classificam preliminarmente células nucleadas, seguidos por revisão de especialistas. O foco está em classificações celulares críticas erradas com potencial para diagnóstico equivocado.

Fluxo de trabalho para citomorfologia digital automatizada de sangue periférico e medula óssea, com consideração de classificações celulares críticas erradas

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine.  Here, we present a protocol for standardized high-content imaging and data processing of propidium iodide (PI)/Hoechst 33342-stained cells to perform reproducible cell viability analysis using automated image acquisition and analysis workflows.

Fluxo de Trabalho Padronizado para Imagem de Alto Conteúdo e Processamento de Dados

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