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</ol>

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td>PCR reactions (Tables 1, 3)</td></tr><tr><td>10X PBS, pH 7.4</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td>Staining buffer base (Steps 3.2&ndash;3.3)</td></tr><tr><td>5X Q5 Reaction Buffer</td><td>NEB</td><td>B9027S</td><td>Sold separately; also included with Q5 polymerase</td></tr><tr><td>Agar, Bacto</td><td>BD Difco</td><td>281230-500g</td><td>SDCAA agar plates (Table 5); 15 g/L</td></tr><tr><td>Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Gel Electrophoresis</td></tr><tr><td>Anti-FLAG PE Antibody</td><td>BioLegend</td><td>637309</td><td>FACS staining; PE-conjugated anti-FLAG</td></tr><tr><td>Anti-HA Tag Antibody [FITC]</td><td>GenScript</td><td>A01621</td><td>FACS staining; FITC-conjugated anti-HA</td></tr><tr><td>Bacto Casamino Acids</td><td>BD Difco</td><td>223120</td><td>SDCAA+, SGCAA+, SCAA media (Table 5); 5 g/L</td></tr><tr><td>Bacto Peptone / Tryptone</td><td>RPI</td><td>T60060-10000.0</td><td>LB/SOB media preparation; 20 g/L in YPD (Table 5)</td></tr><tr><td>BSA, Bovine Serum Albumin, Fraction V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126575-10GM</td><td>0.5% in PBS; staining buffer (Steps 3.2&ndash;3.3)</td></tr><tr><td>BsmBI-v2 (200 U)</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td>Golden Gate assembly of substrate cassette (Table 8)</td></tr><tr><td>Calcium chloride solution (1M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100mL</td><td>Electroporation buffer: 1 mM final (Table 5)</td></tr><tr><td>ColiRollers&reg; Plating Beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71013-3</td><td>Sterilize by putting in reagent bottles and autoclaving at 121&ordm;C, 15 psi, for 15 mins.</td></tr><tr><td>D-Galactose</td><td>Thermo Fisher</td><td>A12813.30</td><td>250 g; 20% w/v stock for SGCAA+ induction (Table 5)</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Thermo Fisher</td><td>1327300.10</td><td>Electroporation buffer (1 M) and outgrowth media (Table 5)</td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glucose), anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>YPD, SDCAA+, 20% w/v dextrose stock (Table 5)</td></tr><tr><td>Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids</td><td>Sigma</td><td>Y0626-250G</td><td>6.7 g/L in SDCAA/SGCAA (Table 5)</td></tr><tr><td>Difco YPD Broth (pre-mixed)</td><td>BD</td><td>242820-500g</td><td>Pre-made YPD alternative; 500 g</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Conditioning buffer: 10 mM final; aliquot 250 &mu;L, store &minus;20&deg;C</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. CyclePure PCR Purification Kit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6492-02</td><td>PCR product cleanup</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Gel Extraction Kit</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D2500-01</td><td>Gel purification post-PCR and restriction digest (Steps 1.1.8, 1.3.2)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td><td>Omega Bio-tek</td><td>D6942-02</td><td>Plasmid purification (Step 4.2)</td></tr><tr><td>Glycerol (&ge;99%)</td><td>Fisher</td><td>BP229-4</td><td>50% v/v stock for glycerol stocks (Step 4.1.1)</td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td>SDCAA+ and SGCAA+: 50 &mu;g/mL final; replaces Sigma K0879-5G</td></tr><tr><td>KLD Enzyme Mix</td><td>NEB</td><td>M0554S</td><td>Kinase-Ligase-DpnI; site-directed mutagenesis</td></tr><tr><td>KLD Reaction Buffer</td><td>NEB</td><td>B0554A</td><td>Used with KLD Enzyme Mix</td></tr><tr><td>LB Broth (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td>E. coli liquid culture</td></tr><tr><td>Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc&middot;2H2O)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A17921.30</td><td>Conditioning buffer: 0.1 M final; add before DTT (Table 5)</td></tr><tr><td>Luria Agar (Luria-Bertani Agar)</td><td>RPI</td><td>L24020-2000.0</td><td>E. coli plating; replaces Sigma LB Agar Lennox L2897-1KG</td></tr><tr><td>OmniPur Casamino Acids</td><td>Sigma</td><td>2240-500GM</td><td>Alternative casamino acids source</td></tr><tr><td>pDD1523</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-TRP-CEN/ARS-Gal10-SPAga2-BsaI; Gal1-Aga2-sfGFP</td></tr><tr><td>pDD1524</td><td>Zenodo</td><td>10.5281/zenodo. 20746804</td><td>pCTCon2-Aga2-6xHis-ENLYFQS-FLAG-ENLYFES-HA-ERS</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>SDCAA+, SGCAA+: 1X final</td></tr><tr><td>PstI-HF (5000 U)</td><td>NEB</td><td>R3140S</td><td>Vector linearization (Table 10); use HF version</td></tr><tr><td>Q5 HF DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>High-fidelity polymerase; alternative to Q5 Hot Start</td></tr><tr><td>Q5 High GC Enhancer</td><td>NEB</td><td>B9028A</td><td>For high GC-content PCR reactions</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>PCR assembly and amplification (Tables 1, 3)</td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer (10X)</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td>Supplied with PstI-HF and SphI-HF (Table 10)</td></tr><tr><td>SalI-HF</td><td>NEB</td><td>R3138L</td><td>Additional restriction enzyme</td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td>Post-transformation recovery</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td>LB / SOB media preparation</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td>Media pH adjustment</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-500G</td><td>SDCAA plates, SCAA media: 38 mM (Table 5)</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Monobasic, anhydrous</td><td>VWR (BDH)</td><td>BDH4542-1KGP</td><td>SD

fluxo de trabalho otimizado de exibição de superfície de levedura para evolução dirigida de proteases

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Fluxo de Trabalho Otimizado de Exibição de Superfície de Levedura para Evolução Dirigida de Proteases

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