Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

İntegratif Toplu, Tek Hücre ve Uzamsal Transkriptomik Analizler, Osteosarkomda PPARG'yi Senesansla İlişkili Aday Bir Prognostik Gen Olarak Belirlemektedir

5 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/73062

⸱

25 Eylül 2026

 ,  ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine Department, Liuzhou People's Hospital, 2Spinal Surgery Department, Liuzhou People's Hospital, 3Maternal and Child Health Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Yığın, tek hücre ve mekansal transkriptomik analizlerin yanı sıra makine öğrenimi tabanlı sağkalım modellemesi ve deneysel doğrulamanın kullanıldığı bu çalışma, PPARG'yi osteosarkomda yaşlanma ile ilişkili bir aday prognostik gen olarak belirlemekte ve düşük ekspresyonunu TARGET-OS'taki kötü sağkalım ile vasküler ve mikroçevresel özelliklerle ilişkilendirmektedir.

Özet

Osteosarkom; metastatik, nüks eden veya tedaviye dirençli hastalık durumlarında zorlayıcı olmaya devam etmektedir. Bu çalışma, senesans ile ilişkili prognostik genleri belirlemeyi ve bunların uzamsal bağlamlarını karakterize etmeyi amaçlamıştır. GSE99671'de DESeq2 kullanılarak eşleştirilmiş diferansiyel ekspresyon analizi yapılmış, ardından CellAge senesans gen seti ile kesişim analizi gerçekleştirilmiştir. TARGET-OS kohortuna ait transkriptomik veriler UCSC Xena'dan elde edilmiştir. Aday genler; tek değişkenli Cox regresyonu, Kaplan-Meier analizi, zamana bağımlı alıcı işletim karakteristik analizi, LASSO Cox regresyonu, tekrarlanan LASSO analizi ve rastgele sağkalım ormanı modellemesi kullanılarak değerlendirilmiş ve klinik kovaryatlar düzeltilmiş Cox modellerine dahil edilmiştir. Karakterizasyon için fonksiyonel zenginleştirme, immün mikroçevre analizi, tek hücre transkriptomiği, SP_BS3 uzamsal transkriptomiği, GSE36001 ekspresyon doğrulaması ile osteosarkom 143B hücreleri ve osteoblast hücrelerinde qRT-PCR ve Western blot doğrulamaları kullanılmıştır. GSE99671'de, düzeltilmiş P < 0.05 ile 2.248 gen diferansiyel olarak eksprese edilmiş ve bunların 866 CellAge geni ile kesişimi 105 senesansla ilişkili diferansiyel eksprese gen vermiştir. TARGET-OS'ta, daha düşük PPARG ekspresyonu daha yüksek mortalite riski ile ilişkili bulunmuştur (tek değişkenli HR = 0.603, 95% CI = 0.454–0.802, P = 0.000494; düzeltilmiş HR = 0.224, 95% CI = 0.085–0.589, P = 0.00241). Klinik modele PPARG'nin eklenmesi, C-indeksini 0.707'den 0.829'a yükseltmiştir. PPARG hem GSE99671 hem de GSE36001'de downregüle olmuştur ve qRT-PCR ile Western blotting, osteosarkom 143B hücrelerinde PPARG mRNA ve protein ekspresyonunun osteoblast hücrelerine göre daha düşük olduğunu doğrulamıştır. Tek hücre analizi PPARG'yi endotel hücreleri, perisitler, makrofajlar/monositler ve tümörle ilişkili stromal hücrelerde lokalize etmiştir. Uzamsal transkriptomik analiz, PPARG ekspresyonu ile CellAge senesans, endotel ilişkili ve perisit ilişkili skorlar arasında zayıf ancak anlamlı pozitif korelasyonlar olduğunu göstermiştir. Bu bulgular, PPARG'yi osteosarkomda olumsuz sağkalım ve vasküler mikroçevresel özelliklerle ilişkili, CellAge türevli bir aday prognostik biyobelirteç olarak önermekte ve risk stratifikasyonu ile senesansla ilişkili tümör mikroçevresi üzerindeki potansiyel ilişkisinin araştırılmasını desteklemektedir. GSE36001 yalnızca harici ekspresyon doğrulaması sağlamıştır; bağımsız sağkalım doğrulaması yapılmamıştır.

Giriş

Osteosarkom, çocuklarda, ergenlerde ve genç yetişkinlerde görülen en yaygın primer malign kemik tümörüdür1. Çoklu ajan kemoterapisinin cerrahi ile kombinasyonu lokalize hastalık için sonuçları iyileştirmiş olsa da2,3, metastatik, rekürren veya tedaviye dirençli osteosarkomu olan hastaların uzun dönemli sağkalım oranları düşük kalmaya devam etmektedir3,4. Yeni kanıtlar, oksidatif stresle tetiklenen epigenetik yeniden modellemenin metastatik adaptasyonu ve tümör ilerlemesini kolaylaştırabileceğini göstermekte ve agresif kanser fenotiplerinin temelinde yatan karmaşık moleküler plastisiteyi vurgulamaktadır5. Hem klinik olarak yorumlanabilen hem de biyolojik olarak bilgilendirici olan güçlü biyobelirteçlerin sayısı hala sınırlıdır. Bu nedenle, verilerin birden fazla katmanı boyunca osteosarkom heterojenliğini ve prognostik riski ortaya koyan moleküler özelliklerin belirlenmesi önemini korumaktadır.

Hücresel yaşlanma (senesans); telomer disfonksiyonu, DNA hasarı, oksidatif stres, onkogen aktivasyonu ve terapötik baskı ile indüklenen stabil bir hücre döngüsü durdurma programıdır6. Yaşlanma, anormal proliferasyonu kısıtlayabilir; ancak yaşlanmış hücreler aynı zamanda inflamatuar, kemokin, büyüme faktörü ve hücre dışı matris yeniden şekillendirme programları aracılığıyla tümör mikroçevresini yeniden düzenleyebilir7,8. Osteosarkomda, yaşlanma ile ilişkili genler hem tümör hücresine özgü stres durumlarını hem de malign olmayan mikroçevresel bölmeleri yansıtabilir, ancak bunların prognostik önemi vele mekansal organizasyonu sistematik olarak değerlendirilmemiştir.

PPARG, lipid metabolizması, inflamatuar düzenleme, hücresel diferansiyasyon ve immün modülasyonda rol oynayan ligand ile aktive olan bir nükleer reseptör olan peroksizom proliferatörle aktive olan reseptör gammanın kodされました9. PPARG'nin kanserdeki rolü bağlama göre değişkenlik gösterir10. Bazı durumlarda PPARG, diferansiyasyon ve anti-inflamatuar durumlarla ilişkilendirilirken, diğer durumlarda adaptif tümör veya stromal programları destekleyebilir. Bununla birlikte, osteosarkomdaki ekspresyon paterni, prognostik değeri, hücresel ve uzamsal lokalizasyonu henüz tam olarak karakterize edilmemiştir.

Bu çalışmada, GSE99671'deki diferansiyel eksprese olan genler belirlenmiş ve CellAge senesans gen seti ile kesiştirilerek 105 adet senesansla ilişkili diferansiyel eksprese gen elde edilmiştir. Ardından, PPARG'yi çekirdek gen olarak belirlemek için TARGET-OS sağkalım verileri, çoklu makine öğrenimi ve sağkalım modelleme yaklaşımları ile klinik düzeltmeler kullanılmıştır. PPARG; bulk fonksiyonel ve immün mikroçevre analizleri, tek hücre transkriptomiği, uzamsal transkriptomik, GSE36001'den harici ekspresyon doğrulaması ile 143B osteosarkom hücre hattı ve insan osteoblastlarında qRT-PCR ve Western blot doğrulaması kullanılarak daha ayrıntılı bir şekilde karakterize edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada analiz ve doğrulama için halka açık veri setleri ve hücre hatları kullanılmış olup, insan katılımcılar veya klinik doku örnekleri yer almamıştır; bu nedenle etik onay gerekmemiştir.

GSE99671 ve CellAge kesişiminde diferansiyel ekspresyon analizi
GSE99671 için ham sayım verileri ve örnek gruplandırma bilgileri GEO'dan elde edildi11,12. On sekiz çift osteosarkom ve eşleştirilmiş normal örnek analiz edildi. Eşleştirilmiş diferansiyel ekspresyon analizi, pair_id'nin eşleştirilmiş birey etkilerini, condition'ın ise tümör dokusunu normal doku ile karşılaştırdığı ~ pair_id + condition tasarım formülü ile DESeq2 kullanılarak gerçekleştirildi13. En az üç örnekte okuma sayısı en az 10 olan genler korundu. Diferansiyel ekspresyon, düzeltilmiş P < 0,05 olarak tanımlandı ve görselleştirme için düzeltilmiş P < 0,05 ve |log2FC| ≥ 1 şeklindeki daha katı bir eşik uygulandı. Gen sembolleri büyük harfe dönüştürüldükten sonra, diferansiyel olarak eksprese edilen genler 866 CellAge senesans geni ile kesiştirildi14. Diferansiyel ekspresyon analizi, DESeq2 (versiyon 1.40.2) kullanılarak R'da (versiyon 4.3.2) gerçekleştirildi ve düzeltilmiş P değerleri Benjamini-Hochberg yöntemi kullanılarak hesaplandı.

TARGET-OS kohortu ve prognostik modelleme
TARGET-OS transkriptomik ve klinik verileri UCSC Xena'dan elde edildi15. Senesansla ilişkili 105 diferansiyel eksprese genin ekspresyon değerleri çıkarıldı. Tam sağkalım süresi, sağkalım durumu ve aday gen ekspresyon verilerine sahip olan, 27 ölüm olayının gerçekleştiği seksen beş hasta çalışmaya dahil edildi. Standartlaştırılmış gen ekspresyon değerleri; tek değişkenli Cox regresyonu16, Kaplan-Meier sağkalım analizi ve zamana bağlı alıcı işletim karakteristiği (ROC) analizi17 kullanılarak analiz edildi. Seçim stabilitesini ve değişken önemini değerlendirmek için LASSO Cox regresyonu18, tekrarlanan LASSO stabilite analizi ve rastgele sağkalım ormanı modellemesi kullanıldı19. Entegre merkez skor ve klinik entegre sıralama, aşağıda detaylandırılan açık ikili kriterler kullanılarak hesaplandı. Sağkalım analizleri R programında survival (versiyon 3.5-7), timeROC (versiyon 0.4), glmnet (versiyon 4.1-8) ve randomForestSRC (versiyon 3.2.2) paketleri kullanılarak gerçekleştirildi. 105 aday genin tek değişkenli Cox taraması için Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı (FDR) düzeltmesi uygulandı ve FDR < 0.05 olan genler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Model ön işlemesi, PPARG gruplandırması ve zamana bağlı ROC analizi
27 ölüm vakasının olduğu 85 hasta arasında, varyansı sıfır olan genler hariç tutulmuş, eksik aday gen ekspresyon değerleri medyan ile tamamlanmış ve her bir aday gen z-skoru ile standardize edilmiştir. Kaplan-Meier analizi için ekspresyon, kohort medyanına göre iki gruba ayrılmıştır: medyanın kesinlikle üzerindeki değerler yüksek ekspresyon grubuna, medyan veya altındaki değerler ise düşük ekspresyon grubuna atanmıştır (PPARG: n = 42 yüksek ve n = 43 düşük). Log-rank testleri çift yönlü olarak gerçekleştirilmiştir. Zamana bağlı ROC analizlerinde, olay nedeni = 1, marjinal ters sansürleme olasılığı ağırlıklandırması, 365, 1.095 ve 1.825 günlük değerlendirme süreleri ve iid = FALSE parametreleri ile timeROC kullanılmıştır. Daha yüksek belirteç değerlerinin tutarlı bir şekilde daha yüksek riski göstermesini sağlamak için, pozitif Cox katsayılarına sahip genler için standardize edilmiş ekspresyon değerleri kullanılmış ve negatif katsayılara sahip koruyucu genler için bu değerler -1 ile çarpılmıştır.

LASSO ve tekrarlanan LASSO
Cox LASSO, glmnet kullanılarak family = "cox", alpha = 1, ön z-skoru standardizasyonu (bu nedenle standardize = FALSE), beşli çapraz doğrulama, type.measure = "deviance" ve 123 rastgele tohumu ile uygulanmıştır. Birincil katsayı çözümü için lambda.min kullanılmıştır. Stabilite analizi, aynı beşli çapraz doğrulamayı 300 kez tekrarlamıştır; b tekrarı için 1000 + b (b = 1,...,300) tohumu kullanılmıştır. Her gen için seçim frekansı, lambda.min değerinde sıfırdan farklı katsayıya sahip tekrarların oranı olarak belirlenmiş; lambda.1se değerindeki sıfırdan farklı seçimler de kaydedilmiştir.

Rastgele sağkalım ormanı
Seed 123, ntree = 1,000, importance = TRUE ve na.action = "na.impute" kullanılarak, randomForestSRC (versiyon 3.2.2) ile standartlaştırılmış 105 aday genin tamamına bir sağkalım ormanı uygulanmıştır. Sağkalım verileri için paket varsayılanları korunmuştur: log-rank bölünme, mtry = 11 (105 öngörücünün karekökünün tavan değeri), minimum terminal düğüm boyutu = 15, nsplit = 10 rastgele bölünme noktası, 0.632 örnekleme oranı ile yerine koymadan örnekleme ve anti-split değişken önemi.

Entegre hub skoru
CellAge ile ilişkili farklı şekilde eksprese edilen 105 aday genin her biri, altı ikili kriterin her biri için bir puan almıştır: (1) farklı ekspresyon/CellAge kesişim üyeliği (puanlama öncesinde düzeltilmiş P < 0.05 şartı arandığı için tüm adaylar bu puanı almıştır); (2) nominal tek değişkenli Cox P < 0.05; (3) Kaplan-Meier log-rank P < 0.05; (4) ortalama 3 ve 5 yıllık zamana bağlı AUC ≥ 0.65; (5) adaylar arasında lambda.min tekrarlı-LASSO seçim frekansının 70. persentil ve üzerinde olması ve > 0 olması; ve (6) adaylar arasında rastgele sağkalım ormanı (random-survival-forest) önem derecesinin 70. persentil ve üzerinde olması ve > 0 olması. Tüm kriterler eşit birim ağırlığa sahip olup 0 ile 6 arasında bir hub skoru vermiştir; ≥ 4 puan alan genler klinik düzeltme aşamasına geçmiştir (18 gen). Tek değişkenli Cox FDR değerleri de raporlanmış ve çoklu test anlamlılığını belirtmek için FDR < 0.05 kullanılmıştır, ancak önceden belirlenmiş puanlama göstergesi için nominal P < 0.05 kullanılmıştır.

Klinik entegreli sıralama
Ekspresyon ve klinik kayıtlar birleştirildikten sonra, düzeltilmiş analizler, tam kovaryat kayıtlarına sahip 40 hastayı ve 13 ölümü kapsadı. Final puanı, başlangıç hub puanına ek olarak yedi kriterin her biri için birer puan verilerek hesaplandı: düzeltilmiş Cox P < 0.05, düzeltilmiş Cox P < 0.10, kesin cerrahi çıkarıldıktan sonra duyarlılık Cox P < 0.05, duyarlılık Cox P < 0.10, ortalama 3 ve 5 yıllık AUC ≥ 0.65, klinik-artı-gen modeline karşı yalnızca klinik model için olabilirlik oran testi P < 0.10 ve delta AIC < 0. 0.05 ve 0.10 eşikleri iç içe geçtiği için, P < 0.05 iki puan katkı sağladı ve böylece belirgin şekilde anlamlı düzeltilmiş ve duyarlılık Cox kanıtlarına daha fazla ağırlık verildi. Toplam puan aralığı 0 ile 13 arasındaydı; eşitlikler önce daha küçük düzeltilmiş Cox P değeri, ardından daha büyük ortalama 3-/5-yıllık AUC ile çözüldü. PPARG, başlangıçtaki altı puanın tamamını ve tüm yedi klinik entegrasyon puanını alarak (13/13) birinci sırada yer aldı. C-indeksi iyileşmesi tanımlayıcı olarak raporlandı ve herhangi bir puan atanmadı.

Klinik ayarlama
Aday hub genler; cinsiyet, yaş, tanı anındaki hastalık durumu, primer tümör bölgesi, spesifik tümör alanı ve kesin cerrahi dahil olmak üzere TARGET-OS klinik değişkenleri ile entegre edildi. Aralarında 13 ölümün bulunduğu, tam ekspresyon ve klinik kayıtları olan kırk hasta klinik ayarlamalı analizlere dahil edildi. Yalnızca klinik değişkenleri içeren Cox modelleri, klinik değişkenlere ek olarak gen ekspresyonunu içeren modellerle karşılaştırıldı. Model iyileşmesini değerlendirmek için C-indeksi, Akaike bilgi kriteri (AIC) ve olasılık oranı testi P değerleri kullanıldı. Cerrahi değişkeni çıkarıldıktan sonra sensitivite analizi gerçekleştirildi.

Fonksiyonel zenginleştirme ve immün mikroçevre analizi
TARGET-OS örnekleri PPARG ekspresyonuna göre tabakalandırılmıştır. PPARG-yüksek ve PPARG-düşük gruplar arasındaki diferansiyel ekspresyon, gen seti zenginleştirme analizi (GSEA)20 için sıralanmış gen listeleri oluşturmak amacıyla kullanılmıştır. Gösterilen yolaklar Nemeth Inflammatory Response LPS Up, Burton Adipogenesis 5, Burton Adipogenesis 6, Krieg KDM3A Targets Not Hypoxia, Reactome: Transcriptional Regulation By TP53, Fulcher Inflammatory Response Lectin Vs LPS Dn, Hollmann Apoptosis Via CD40 Dn, Zhou Inflammatory Response Live Dn, WP: Fatty Acids And Lipoproteins Transport In Hepatocytes, Sweet Lung Cancer KRAS Up, KEGG Medicus Pathogen HIV Tat To TLR2/4 NF-kB Signaling Pathway ve Reactome: Fatty Acids'tır. Toplu bir CellAge senesans skoru hesaplanmış ve PPARG ile senesans genleri veya immün mikroçevre imzaları arasındaki ilişkileri değerlendirmek için Spearman korelasyon analizi kullanılmıştır21. PPARG-yüksek ve PPARG-düşük gruplar arasındaki mikroçevre skorlarındaki farklar, çoklu test düzeltmeli non-parametrik testler kullanılarak değerlendirilmiştir.

Tek hücreli transkriptomik analiz
Yayımlanmış bir insan osteosarkom tek hücreli transkriptomik veri seti; kalite kontrolü, boyut indirgeme, kümeleme ve manuel anotasyonu önceden tamamlanmış bir ön işlemeli nesne kullanılarak analiz edilmiştir22,23,24. Toplam 68.336 hücre ve 32.297 gen dahil edilmiştir. Ana metin yorumlaması için anotasyonlar 13 ana hücre tipine basitleştirilmiştir: B hücreleri, CAF'lar, döngüdeki hücreler, endotel hücreleri, eritroid hücreler, makrofajlar/monositler, malign osteosarkom hücreleri, miyojenik hücreler, nötrofiller, osteoklast benzeri hücreler, perisitler, T/NK hücreleri ve tümörle ilişkili stromal hücreler. PPARG lokalizasyonunu görselleştirmek için boyut indirgeme, özellik ekspresyonu, nokta ve keman grafikleri kullanılmıştır. PPARG-pozitif hücreler, ekspresyonu sıfırdan büyük olan hücreler olarak tanımlanmıştır. Hücre tipleri arasındaki farklar, Benjamini-Hochberg düzeltmesi ile birlikte Kruskal-Wallis ve Wilcoxon sıra toplamı testleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Tek hücreli analizler, R programında Seurat (versiyon 5.0.1) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Uzamsal transkriptomik analiz
Spatyal bir ekspresyon nesnesi oluşturmak için SP_BS3 uzamsal transkriptomik örneği kullanılmıştır25,26. Kalite kontrol eşikleri nFeature_Spatial ≥ 200 ve percent.mt ≤ 30 olarak belirlenmiş ve analiz için 4.572 spot kalmıştır. Veriler normalize edilmiş, 3.000 yüksek değişkenlik gösteren gen seçilmiş; veri ölçeklendirme, temel bileşen analizi, komşuluk grafiği oluşturma, uzamsal spot kümeleme ve boyut indirgeme işlemleri gerçekleştirilmiştir. Döngüsel korelasyonu önlemek amacıyla gen setinden PPARG çıkarıldıktan sonra uzamsal bir CellAge senesans skoru hesaplanmıştır. Endotelyal, perisit, makrofaj/monosit, tümörle ilişkili stromal, malign osteosarkom ve osteoklast benzeri imzalar oluşturulmuş ve skorlanmıştır. PPARG ekspresyonu ile uzamsal skorlar arasındaki ilişkileri değerlendirmek için Spearman korelasyon analizi kullanılmıştır. Her bir spot için öngörülen hücre tipi skorlarını belirlemek amacıyla, tek hücreli veri seti referans, uzamsal veri seti ise sorgu olarak kullanılarak etiket transferi gerçekleştirilmiştir23,24. Uzamsal transkriptomik analizler R dilinde Seurat (versiyon 5.0.1) kullanılarak yapılmış ve tüm uzamsal korelasyon P değerlerine Benjamini-Hochberg FDR düzeltmesi uygulanmıştır.

GSE36001'de harici ekspresyon doğrulaması
GEO veri seti GSE36001, yalnızca bağımsız bir ekspresyon doğrulama kohortu olarak kullanılmıştır; sağkalım sonuçları mevcut olmadığı için prognostik doğrulama amacıyla kullanılmamıştır11,27. Veri seti, 19 osteosarkom örneği ve altı normal kontrol örneği içermekteydi. Prob tanımlayıcılarını gen sembollerine dönüştürmek için GPL6102 platform anotasyonu kullanılmıştır. Birden fazla prob aynı gene eşleştiğinde, ortalama ekspresyonu en yüksek olan prob tutulmuştur. Tümör ve normal gruplar arasındaki diferansiyel ekspresyon limma kullanılarak değerlendirilmiştir28. Analizler, R ortamında limma (versiyon 3.56.2) kullanılarak gerçekleştirilmiş ve düzeltilmiş P değerleri Benjamini-Hochberg yöntemi ile hesaplanmıştır.

qRT-PCR ve Western blot doğrulaması
Deneysel doğrulama, insan osteosarkom hücre hattı 143B ve insan osteoblast hücreleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Osteosarkom hücreleri; %10 fetal bovine serum ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco's modified Eagle's ortamında, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de kültüre edilmiş ve %80-90 konfluense ulaştığında %0,25 trypsin-EDTA ile pasajlanmıştır. İnsan osteoblast hücreleri önerilen kültür koşullarında muhafaza edilmiştir. Tüm hücre hatlarının mikoplazma kontaminasyonu içermediği doğrulanmıştır. qRT-PCR için total RNA, fenol-guanidinyum bazlı bir RNA ekstraksiyon reaktifi kullanılarak ekstrakte edilmiş; RNA konsantrasyonu ve saflığı spektrofotometrik olarak değerlendirilmiştir. Bir mikrogram total RNA, önerilen protokole uygun olarak bir ters transkripsiyon reaktifi kullanılarak ters transkribe edilmiştir. qRT-PCR, floresan DNA-bağlayıcı boya bazlı kimya kullanılarak aşağıdaki döngü koşulları altında gerçekleştirilmiştir: 95 °C'de 30 s başlangıç denatürasyonu, ardından 95 °C'de 5 s ve 60 °C'de 30 s olmak üzere 40 döngü; amplifikasyon özgünlüğünü onaylamak için erime eğrisi analizi yapılmıştır. Her reaksiyon teknik olarak üçte bir şeklinde gerçekleştirilmiş ve üç bağımsız biyolojik deney yürütülmüştür. Dahili kontrol olarak GAPDH kullanılmış ve bağıl PPARG ekspresyonu 2-ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplanmıştır29. PPARG ileri primer dizisi 5'-CGAAGACATTCCATTCACAAGAACAG-3', geri primer dizisi ise 5'-AGATGCAGGCTCCACTTTGATTG-3' şeklindedir.

PPARG protein ekspresyonunu incelemek için Western blotting yapıldı. Hücreler, proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş radyoimmünpresipitasyon analiz tamponunda lize edildi ve protein konsantrasyonları bisinkoninik asit testi kullanılarak belirlendi. Eşit miktardaki proteinler (%10 sodyum dodecil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıştırılarak her kuyucuğa 30 µg gelecek şekilde) poliviniliden diflorür membranlara aktarıldı. Membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 yağsız süt ile bloke edildikten sonra PPARG (1:1.000) ve GAPDH (1:5.000) primer antikorları ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi ve ardından oda sıcaklığında 1 saat boyunca horseradish peroksidaz-konjuge ikincil antikor (1:5.000) ile inkübe edildi. Protein bantları kemilüminesans deteksiyonu kullanılarak görselleştirildi ve üç bağımsız deney gerçekleştirildi. Bant yoğunlukları, görüntü analiz yazılımı kullanılarakle ölçüldü30. Gruplar arası farklar, çift kuyruklu eşleştirilmemiş Student t testleri kullanılarak analiz edildi. Veriler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunuldu ve P < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Deneysel verilerin istatistiksel analizleri, istatistiksel analiz yazılımı (versiyon 9.0) kullanılarak gerçekleştirildi.

İstatistiksel analiz
Aksi belirtilmedikçe, tüm biyoinformatik analizler R (versiyon 4.3.2) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İki yönlü P değerleri < 0.05 olanlar istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. Korelasyonlar, Spearman sıra korelasyon katsayısı (ρ) kullanılarak değerlendirilmiştir. Uygulanabildiği yerlerde, çoklu test düzeltmesi Benjamini-Hochberg FDR yöntemiyle yapılmıştır. Deneysel veriler ortalama ± SD olarak sunulmuş ve iki kuyruklu eşleşmemiş Student t testleri kullanılarak karşılaştırılmıştır. Deneysel istatistiksel analizler, istatistiksel analiz yazılımı (versiyon 9.0) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

GSE99671, hücre yaşlanmasıyla (CellAge) ilişkili 105 diferansiyel olarak eksprese edilen gen belirledi
GSE99671, 18 eşleşmiş dokudan alınan 36 örneği içermekteydi. Düşük sayım filtrelemesinin ardından 16.683 gen korundu. Ayarlanmış P < 0,05 değerinde 2.248 gen diferansiyel olarak eksprese edildi. Ayarlanmış P < 0,05 ve |log2FC| ≥ 1 şeklindeki daha sıkı eşik değerinde, tümörlerde yukarı regüle edilmiş 102 ve aşağı regüle edilmiş 492 gen dahil olmak üzere 594 gen anlamlı bulundu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma; diferansiyel ekspresyon analizi, CellAge gen kesişimi, TARGET-OS sağkalım modellemesi, klinik ayarlama, multi-omik lokalizasyon ve deneysel doğrulamayı entegre ederek PPARG'yi osteosarkomda yaşlanma ile ilişkili bir aday prognostik gen olarak belirlemiştir. Bu analitik çerçeve, moleküler bilgiye dayalı osteosarkom araştırmalarına ve yaşlanma ile ilgili biyolojiyi yorumlamak için küratörlü yaşlanma-gen kaynaklarına yönelik mevcut vurgu ile uyumludur14,31

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

YAZAR KATKILARI:
Yongwen Li ve Wentao Qin çalışmayı tasarladı ve kurguladı. Yongwen Li biyoinformatik ve hesaplamalı analizleri gerçekleştirdi. Tuo Liang deneysel doğrulamayı yaptı. Rubiao Qiu ve Zide Zhang şekillerin hazırlanmasına katkıda bulundu. Rubiao Qiu ve Zide Zhang çalışmayı denetledi ve makaleyi kritik olarak gözden geçirdi. Tüm yazarlar nihai makaleyi inceledi ve onayladı

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışmayı mümkün kılan halka açık veri setlerini ve kaynakları sağladıkları için GEO, TARGET-OS, UCSC Xena, CellAge, MSigDB ve insan osteosarkom tek hücreli ve mekansal transkriptomik atlas projelerinin araştırmacılarına ve katkıda bulunanlarına teşekkür ederler. Bu çalışma, Guangxi Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2023GXNSFAA026111) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-GAPDH primer antikoruProteintech Group, Wuhan, China10494-1-APWestern blottingde yükleme kontrolü olarak GAPDH'yi tespit etmek için kullanılan primer antikoru; dilüsyon 1:5.000.
Anti-PPARG primer antikoruProteintech Group, Wuhan, China16643-1-APWestern blotting ile PPARG proteininin tespiti için kullanılan primer antikoru; dilüsyon 1:1.000.
BCA protein analiz kitiBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaPC0020Elektroforez öncesinde toplam protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan kolorimetrik analiz.
DESeq2BioconductorVersion 1.40.2Sayı tabanlı transkriptomik verilerin diferansiyel gen ekspresyon analizi için kullanılan R paketi.
Dulbecco modifiye Eagle ortamı (DMEM)Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, China11995143B osteosarkom hücrelerinin kültürü için kullanılan bazal kültür ortamı.
ECL tespit reaktifiBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaPE0010Western blottingde HRP-konjuge antikorların tespiti için kullanılan kemilüminesans substrat.
Fetal sığır serumu (FBS)Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd. (Sijiqing), Huzhou, Zhejiang, China11011-8611Hücre büyümesini ve canlılığını desteklemek için kültür ortamına eklenen serum takviyesi.
glmnetCRANVersion 4.1-8LASSO ve elastic-net modelleme dahil olmak üzere cezalandırılmış regresyon analizleri için kullanılan R paketi.
GraphPad PrismGraphPad Software, San Diego, CA, USAVersion 9.0İstatistiksel analiz, grafik oluşturma ve deneysel verilerin görselleştirilmesi için kullanılan yazılım.
HRP-konjuge sekonder antikoruProteintech Group, Wuhan, ChinaSA00001-2Western blot tespiti için kullanılan horseradish peroksidaz-konjuge sekonder antikoru; dilüsyon 1:5.000.
İnsan osteoblast hücreleriCell Applications, Inc., San Diego, CA, USA406-05AMalign olmayan karşılaştırma/kontrol hücre tipi olarak kullanılan primer insan osteoblast hücreleri.
İnsan osteosarkom 143B hücre hattıAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USACRL-8303In vitro doğrulama deneyleri ve moleküler analizler için kullanılan insan osteosarkom hücre hattı.
ImageJNational Institutes of Health (NIH), USAVersion 1.53Deneysel görüntülerin kantitatif analizi için kullanılan görüntü analiz yazılımı.
limmaBioconductorVersion 3.56.2Diferansiyel ekspresyon analizi ve doğrusal model tabanlı istatistiksel testler için kullanılan R paketi.
Penisilin-streptomisinBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaP1400Bakteriyel kontaminasyonu azaltmak için hücre kültürü ortamında kullanılan antibiyotik takviyesi.
PPARG ve GAPDH primerleriSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Shanghai, ChinaCustom synthesis; sequences provided in the MethodsPPARG ve GAPDH ekspresyonunun qPCR analizi için kullanılan özel oligonükleotid primerler.
PVDF membranlar, 0.45 µmBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaYA1701Western blotting sırasında protein transferi için kullanılan membranlar.
R istatistik yazılımıR Foundation for Statistical Computing, Vienna, AustriaVersion 4.3.2Biyoenformatik analizler, model oluşturma ve görselleştirme için kullanılan istatistiksel hesaplama ortamı.
randomForestSRCCRANVersion 3.2.2Rastgele sağkalım ormanı modelleme ve özellik önem analizi için kullanılan R paketi.
Ters transkripsiyon kitiBeyotime Biotech Inc., Shanghai, ChinaD7168MKantitatif PCR öncesinde izole RNA'dan tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi için kullanılır.
RIPA lizis tamponuBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaR0010Western blot analizi için hücreleri liz etmek amacıyla kullanılan protein ekstraksiyon tamponu.
SeuratSatija LaboratoryVersion 5.0.1Tek hücreli RNA-dizileme veri işleme, entegrasyon, kümeleme ve görselleştirme için kullanılan R paketi.
survivalCRANVersion 3.5-7Cox orantılı risk modellemesi dahil olmak üzere sağkalım analizi için kullanılan R paketi.
SYBR Green qPCR master mixBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaSR1110Kantitatif gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu için kullanılan floresan master mix.
timeROCCRANVersion 0.4Zamana bağlı alıcı işletim karakteristik eğrileri oluşturmak ve zaman içindeki öngörü performansını hesaplamak için kullanılan R paketi.
TRIzol reaktifiInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15596026CNKültür hücrelerinden toplam RNA ekstraksiyonu için kullanılan reaktif.
Trypsin-EDTA, 0.25%Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Beijing, ChinaT1300Adherent hücrelerin pasajlanması ve hasadı için kullanılan hücre disosiasyon reaktifi.

Kaynaklar

  1. Mirabello L, Troisi RJ, Savage SA. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 2009;115:1531-1543.
  2. Bielack SS, et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. J Clin Oncol. 2002;20:776-790.
  3. Isakoff MS, Bielack SS, Meltzer P, Gorlick R. Osteosarcoma: Current Treatment and a Collaborative Pathway to Success. J Clin Oncol. 2015;33:3029-3035.
  4. Kansara M, Teng MW, Smyth MJ, Thomas DM. Translational biology of osteosarcoma. Nat Rev Cancer. 2014;14:722-735.
  5. Peng P, et al. Epigenetic remodeling under oxidative stress: Mechanisms driving tumor metastasis. MedComm - Oncology. 2024;3.
  6. Muñoz-Espín D, Serrano M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014;15:482-496.
  7. Coppé JP, Desprez PY, Krtolica A, Campisi J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 2010;5:99-118.
  8. Collado M, Serrano M. Senescence in tumours: evidence from mice and humans. Nat Rev Cancer. 2010;10:51-57.
  9. Lehrke M, Lazar MA. The many faces of PPARgamma. Cell. 2005;123:993-999.
  10. Peters JM, Shah YM, Gonzalez FJ. The role of peroxisome proliferator-activated receptors in carcinogenesis and chemoprevention. Nat Rev Cancer. 2012;12:181-195.
  11. Barrett T, et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 2013;41.
  12. Ho XD, et al. Whole transcriptome analysis identifies differentially regulated networks between osteosarcoma and normal bone samples. Exp Biol Med (Maywood). 2017;242:1802-1811.
  13. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15:550.
  14. Avelar RA, et al. A multidimensional systems biology analysis of cellular senescence in aging and disease. Genome Biol. 2020;21:91.
  15. Goldman MJ, et al. Visualizing and interpreting cancer genomics data via the Xena platform. Nat Biotechnol. 2020;38:675-678.
  16. Prentice RL, Zhao S. Regression Models and Multivariate Life Tables. J Am Stat Assoc. 2021;116:1330-1345.
  17. Heagerty PJ, Lumley T, Pepe MS. Time-dependent ROC curves for censored survival data and a diagnostic marker. Biometrics. 2000;56:337-344.
  18. Tibshirani R. The lasso method for variable selection in the Cox model. Stat Med. 1997;16:385-395.
  19. Jaeger BC, et al. OBLIQUE RANDOM SURVIVAL FORESTS. Ann Appl Stat. 2019;13:1847-1883.
  20. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:15545-15550.
  21. Newman AM, et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat Methods. 2015;12:453-457.
  22. Zhou Y, et al. Single-cell RNA landscape of intratumoral heterogeneity and immunosuppressive microenvironment in advanced osteosarcoma. Nat Commun. 2020;11:6322.
  23. Stuart T, et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 2019;177:1888-1902.e21.
  24. Hao Y, et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 2021;184:3573-3587.e29.
  25. Zheng X, et al. A single-cell and spatially resolved atlas of human osteosarcomas. J Hematol Oncol. 2024;17:71.
  26. Ståhl PL, et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 2016;353:78-82.
  27. Kresse SH, et al. Integrative analysis reveals relationships of genetic and epigenetic alterations in osteosarcoma. PLoS One. 2012;7.
  28. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43.
  29. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25:402-408.
  30. Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 2012;9:671-675.
  31. Gill J, Gorlick R. Advancing therapy for osteosarcoma. Nat Rev Clin Oncol. 2021;18:609-624.
  32. Sun L, et al. Single-cell RNA sequencing revealed PPARG promoted osteosarcoma progression: based on osteoclast proliferation. Front Immunol. 2024;15:1506225.
  33. Yuan B, et al. Nuclear receptor modulators inhibit osteosarcoma cell proliferation and tumour growth by regulating the mTOR signaling pathway. Cell Death Dis. 2023;14:51.
  34. Lu Y, et al. Oridonin exerts anticancer effect on osteosarcoma by activating PPAR-γ and inhibiting Nrf2 pathway. Cell Death Dis. 2018;9:15.
  35. Gorgoulis V, et al. Cellular Senescence: Defining a Path Forward. Cell. 2019;179:813-827.
  36. Faget DV, Ren Q, Stewart SA. Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer. Nat Rev Cancer. 2019;19:439-453.
  37. Hernandez-Segura A, et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Curr Biol. 2017;27:2652-2660.e4.
  38. Tian H, et al. Managing the immune microenvironment of osteosarcoma: the outlook for osteosarcoma treatment. Bone Res. 2023;11:11.
  39. Hanahan D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 2022;12:31-46.
  40. Ricote M, Li AC, Willson TM, Kelly CJ, Glass CK. The peroxisome proliferator-activated receptor-gamma is a negative regulator of macrophage activation. Nature. 1998;391:79-82.
  41. Jiang C, Ting AT, Seed B. PPAR-gamma agonists inhibit production of monocyte inflammatory cytokines. Nature. 1998;391:82-86.
  42. McShane LM, et al. REporting recommendations for tumour MARKer prognostic studies (REMARK). Br J Cancer. 2005;93:387-391.
  43. Moses L, Pachter L. Publisher Correction: Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 2022;19:628.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Osteosarkom Prognostik GenleriSenesansla İlişkili GenlerPPARG EkspresyonuTek Hücre TranskriptomiğiUzamsal TranskriptomikDiferansiyel Ekspresyonİmmün MikroçevreCox RegresyonuWestern BlotqRT-PCR
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.