Name: Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Keşfedin, görüntüleme akış sitometrisiyle tedaviye bağlı yaşlanan kanser hücrelerinde çoklu floresan yaşlanma belirteçlerinin eşzamanlı tespiti. Bu yöntem, yüksek çözünürlüklü görüntüler üreterek tek hücre düzeyinde hızlı ve hassas analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Linz Johannes Kepler Üniversitesi'nden Yong Yu'ya verilen bir hibe ile desteklenmiştir (BERM16108001).

1. Hücresel yaşlanmayı indüklemek için mafosfamid veya daunorubisin tedavisi ile DLBCL hücre hatları
NOT: Protokol aynı zamanda yapışkan kanser hücreleri için de çalışır. Hücre büyüklüğüne bağlı olarak, tohum 1-2, 10 5 hücreyi 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna × ve plakayı, işlemden bir gece önce%5 CO2, 37 ° C inkübatörde inkübe edin. Protokol adımları, süspansiyon hücreleri ile aynıdır, ancak iki istisna dışında. İlk olarak, hücrelerin adım 3.4'ten sonra plakadan tripsinize edilmesi gerekir. İkincisi, yıkama adımları tripsinizasyondan önce santrifüjleme yapılmadan gerçekleştirilir.
<ol><li>DLBCL hücrelerini sayın ve kuyu başına 4 mL ortamda 1 × 10 6 hücre / mL'yi6 delikli bir kültür plakasına koyun. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U / mL penisilin / streptomisin ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamında DLBCL hücrelerini geliştirin.</li>
	<li>Hücre kültürüne MAF (5 μg / mL) veya DN (20 ng / mL) ekleyin ve karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın. NOT: MAF ve DN kararlı değildir. DMSO'da çözündükten sonra, stok çözeltisi aliquoted edilmeli ve -20 ° C'de saklanmalıdır. Donma/çözülme döngülerinden kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Plakayı 3 gün boyunca% 5 CO2, 37 ° C inkübatörde inkübe edin.</li>
	<li>3 günlük bir inkübasyondan sonra, DLBCL hücrelerini 15 mL steril santrifüj tüplerinde toplayın ve 5 dakika boyunca 100 × g, 4 ° C'de döndürün.</li>
	<li>Süper natantı atın, hücre peletlerini 4 mL taze ortamla yeniden askıya alın ve süspansiyonları 6 delikli plakaya geri ekleyin.</li>
	<li>Hücre plakasını% 5 CO 2, 37 ° C'lik bir inkübatörde analiz için hasattan önce2 gün daha yetiştirin.</li>
</ol>2. Boyama için çözeltiler hazırlayın (Tablo 1)
3. Farklı yaşlanma belirteçlerine sahip leke DLBCL hücreleri
NOT: Tek tek belirteçlerle boyanmış hücre örnekleri (yani, pasifik mavisi-EdU, C12FDG veya Alexa Fluor 647-γH2AX), ölçüm sırasında floresan yayılımını düzeltmek için bir telafi matrisi oluşturmak üzere hazırlanır. Çok önerilmesine rağmen, farklı floroforlar arasında emisyon spektrumlarının ihmal edilebilir bir örtüşmesi (kompanzasyon katsayısı değeri ≤ 0.1) olduğunda bu adım askıya alınabilir. Bununla birlikte, kullanıcılar farklı cihazlar ve floresan paneller kullanırken standartlaştırılmış kompanzasyon adımlarını belirlemelidir.
<ol><li>Adım 1.6'dan üretilen DLBCL hücre kültürüne 1:1.000 oranında 10 mM EdU çözeltisi ekleyin (son EdU konsantrasyonu 10 μM'dir). % 5 CO2, 37 °C inkübatörde 3 saat boyunca karıştırmak ve inkübe etmek için plakayı yavaşça sallayın.</li>
	<li>Plakayı inkübatörden çıkarın ve 75 μM'lik son konsantrasyona 100 mM klorokin çözeltisi ekleyin (tartışmaya bakınız). % 5 CO2, 37 ° C inkübatörde 30 dakika boyunca karıştırmak ve inkübe etmek için plakayı yavaşça sallayın.</li>
	<li>Plakayı inkübatörden çıkarın ve20μM'lik son C 12 FDG konsantrasyonuna 1: 1.000'de 20 mM C12FDG çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Plakayı inkübatörden çıkarın ve fSA-β-gal lekelenmesini durdurmak için 1:50'de 100 mM 2-feniletil-β-D-tiyogalaktosid (PETG) çözeltisi ekleyin (2 mM'lik son PETG konsantrasyonu). Karıştırmak için plakayı yavaşça döndürün.</li>
	<li>Hücreleri 15 mL steril santrifüj tüplerine aktarın ve 100 × g, 4 °C'de 5 dakika boyunca döndürün. Süpernatantı atın ve hücreleri 4 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.</li>
	<li>PBS yıkama adımını tekrarlayın. Süpernatantı atın ve hücre peletlerini% 4 paraformaldehit fiksasyon çözeltisinin 500 μL'sinde yeniden askıya alın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyondan sonra, 250 × g'da santrifüj, 5 dakika oda sıcaklığında. Süpernatantı atın ve hücreleri 4 mL PBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS yıkama adımını tekrarlayın. Süpernatanı atın, hücre peletini 200 μL saponin geçirgenlik tamponunda yeniden askıya alın ve süspansiyonu yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakikalık inkübasyondan sonra, 250 × g'da santrifüj, 5 dakika oda sıcaklığında.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve hücre peletlerini 200 μL primer antikor çözeltisinde (antikor inkübasyon çözeltisinde 1:500 γH2AX antikoru) yeniden askıya alın. Karanlıkta gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Tüpleri 250 × g, 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve 100 μL saponin yıkama çözeltisi ile yıkayın.</li>
	<li>Yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Süpernatantı atın ve hücre peletlerini 500 μL EdU algılama kokteylinde yeniden askıya alın.</li>
	<li>Karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. 250 × g'da santrifüj, 5 dakika oda sıcaklığında. Süpernatantı atın ve 1 mL saponin yıkama çözeltisi ile yıkayın.</li>
	<li>Yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Süpernatantı atın ve hücre peletlerini 20-50 μL PBS içinde yeniden askıya alın. Numune ölçümü için bölüm 4'e geçin.</li>
</ol>4. Görüntüleme akışı sitometre sistemini kullanarak yaşlanma belirteçlerinin görüntülenmesi
<ol><li>Atık sıvı şişesini boşaltın. Cihazı açmadan önce yeterli sıvıyı sağlamak için hız boncukları, sterilizatör, temizleyici, kabarcıklayıcı, kılıf ve durulama reaktiflerinin (deiyonize su) seviyelerini kontrol edin ( Malzeme Tablosuna bakın).</li>
	<li>Cihaz ve görüntüleme yazılımını açın ( Şekil 1A'daki yazılım arayüzüne bakın).</li>
	<li>Akışkanları ve sistem kalibrasyonunu başlatmak için Başlangıç düğmesine tıklayın. NOT: Bu prosedür yaklaşık 45 dakika sürer.</li>
	<li>Büyütmeyi 40x'e ayarlayın, akışkan hızını düşük olarak ayarlayın ve deneyde gereken lazerleri açın. EdU-pasifik mavisi, C12FDG ve Alexa Fluor 647-γH2AX (veya Alexa Fluor 647-Ki67) ölçmek için sırasıyla 405 nm, 488 nm ve 642 nm lazerleri açın. Dağılım kanalı için Ch6'yı, parlak alan için Ch1 ve Ch9'u ayarlayın.</li>
	<li>Lazerlerin yoğunluğunu ayarlamak için en yüksek floresana sahip olması beklenen numune ile başlayın. Karıştırmak için numune tüpünü yavaşça çevirin. Tüp kapağını açın ve numune tüpünü rıhtıma yerleştirin. Başlamak için Yükle'ye tıklayın.</li>
	<li>Bir dağılım grafiği açın ve sırasıyla X ve Y eksenleri için Area_M01 ve En Boy Ratio_M01 özelliklerini seçin. Aşağıdaki ve sağ taraftaki çiftleri ve hücre toplamlarını ve sol taraftaki hız boncuk popülasyonunu hariç tutmak için 0,5 en boy oranının üzerinde bir kapı ayarlayın (Şekil 1B).</li>
	<li>Bir histogram grafiği açın ve X ekseni için unsur Degrade RMS_M01_Ch01 seçin. Tekli popülasyonu seçin ve odaklanmış hücreler için seçilecek kapıyı ayarlayın (Şekil 1C). NOT: Görüntüleme sistemi, görüntüleme odağını ayarlamak için otomatik olarak hız boncuklarını kullanacaktır. Bununla birlikte, en iyi odaklanmış popülasyon için histogram zirvesinin sağ yarısının seçilmesi önerilir.</li>
	<li>Bir histogram grafiği açın ve her renk kanalı (Ch2, 7 ve 11) için X ekseni için Ham Maksimum Piksel Yoğunlukları'nı seçin. Lazer güçlerini ayarlayın (yani, Ch2, 7 ve 11 için sırasıyla 488 nm, 405 nm ve 642 nm lazerler), böylece her florokromun aşırı doygunluğu önlemek için 100 ila 4.000 arasında bir Ham Maksimum Piksel değeri vardır. NOT: Bu deney için, lazer güç ayarı 488 nm, 405 nm ve 642 nm lazerler için sırasıyla 50 mW, 200 mW ve 50 mW'dir.</li>
	<li>Kaydedilecek odaklanmış popülasyonu seçin ve DLBCL örneklerini tutarlı ayarlarla ölçmek için Al'a tıklayın. Numuneleri ölçüm için değiştirirken, numune tüpünü kurtarmak için Geri Dön'e tıklayın. Örneği atmak için Yükle'ye basın.</li>
	<li>Tüm numuneler ölçüldükten sonra, parlak alan ve saçılma lazerini kapatın. Bir ücret matrisi oluşturmak için tek renkli kontrol örneklerini ölçün.</li>
	<li>Görüntüleme sistemini kapatmak için Kapat'a tıklayın.</li>
	<li>Görüntü analiz yazılımındaki verileri analiz edin.<ol><li>Canlı hücre görüntülerindeki nükleer γH2AX odaklarını otomatik olarak saymak ve ölçmek için görüntü analiz yazılımının Spot Sihirbazı aracını kullanın. Nokta sihirbazını daha fazla otomatik nokta sayımı analizi için eğitmek üzere iki hücre popülasyonu (biri yüksek, diğeri düşük nokta sayısına sahip) seçin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li>
<li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li>
<li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347(2010).</li>
<li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li>
<li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype%3A+one+in+vivo+reality%2C+two+possible+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li>
<li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+cancer+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li>
<li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li>
<li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+senescence%3A+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li>
<li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li>
<li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li>
<li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651(2020).</li>
<li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+in+ageing%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li>
<li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li>
<li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li>
<li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li>
<li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+stress-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li>
<li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740(2021).</li>
<li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Bu yöntem, kemoterapi tedavisi üzerine dört farklı DLBCL hücre hattının yaşlanma giriş kabiliyetini, parlak alan görüntüleme ve akış sitometrisine dayalı niceleme ile inceledi. Tek hücreli bir düzeyde, tedavi edilen KARPAS422 ve WSU-DLCL2 hücrelerinde ve OCI-LY1 hücrelerinde daha az ölçüde majör C12FDG + EdU-Ki67 + yaşlanan popülasyonları başarıyla tespit ettik, SU-DHL6 hücre hattı tedaviye dirençliydi. Hücre hatları arasındaki yaşlanma giriş kabiliyetindeki fark, farklı genomi...

Çeşitli uyaranlar hücresel yaşlanmayı tetikleyebilir ve hücrelerin kararlı bir hücre döngüsü tutuklaması durumuna girmesine neden olabilir. Bu uyaranlar, içsel sinyal değişikliklerini veya dışsal stresleri içerir. İçsel sinyaller arasında ilerleyici telomer kısalması, telomer yapısındaki değişiklikler, epigenetik modifikasyon, proteostaz bozuklukları, mitokondriyal disfonksiyon ve onkogenlerin aktivasyonu sayılabilir. Dışsal stresler arasında enflamatuar ve/veya doku hasarı sinyalleri, radyasyon veya kimyasal tedavi ve beslenme yoksunluğu 1,2,3,4 bulunur. Farklı yaşlanma türleri arasında en sık görülen ve iyi çalışılanlar replikatif yaşlanma, onkogen kaynaklı yaşlanma (OIS), radyasyona bağlı yaşlanma ve tedaviye bağlı yaşlanmadır (TIS). OIS, anormal onkogen aktivasyonu ile oluşan replikatif stresin neden olduğu genotoksik hasara akut hücresel bir yanıttır ve bir dereceye kadar preneoplastik bir lezyondan tam gelişmiş bir tümöre patolojik ilerlemeyi önleyebilir. TIS, tümör hücreleri kemoterapötik ilaçlar veya iyonlaştırıcı radyasyon 5,6 ile strese girdiğinde meydana gelir.
Yaşlanma, son derece dinamik doğası nedeniyle patolojide iki ucu keskin bir kılıç olarak kabul edilir. Başlangıçta, hasarlı hücreleri bölünen hücrelerin dolaşım havuzundan çıkarmak, organların normal işlevini korumak ve tümör büyümesini inhibe etmek için yararlı bir tümör baskılayıcı mekanizma olarak tanımlanmıştır 7,8,9. Bununla birlikte, ortaya çıkan kanıtlar yaşlanmanın karanlık bir tarafını öne sürmüştür. Yaşlanan hücreler, yaşlanma ile ilişkili sekretuar fenotip (SASP) olarak bilinen proinflamatuar sitokinler salgılar, fibroz ve arızalı organlara yol açar ve tümörün başlamasını ve ilerlemesini teşvik eder10. Ayrıca, yaşlanan kanser hücreleri, kromatin yeniden şekillenmesine ve sürekli bir DNA hasarı yanıtının (DDR) aktivasyonuna paralel olarak epigenetik ve gen ekspresyonu yeniden programlamasına tabi tutulur 11,12, yeni kanser-kök hücre özellikleri3. Her ne kadar yaşlanma yeteneğine sahip tümörler yaşlanma yeteneğine sahip olmayanlara kıyasla terapötik müdahaleye daha iyi yanıt verse de13, yaşlanan hücrelerin kalıcılığı, senolitik ilaçlarla etkili bir şekilde tanımlanmadıkları ve elimine edilmedikleri takdirde uzun vadeli prognozun kötü olmasına neden olabilir5. Her iki durumda da, yaşlanmayı değerlendirmek için güvenilir bir yöntem, sadece tedavi tedavisinin prognozu için değil, aynı zamanda yaşlanan hücreleri hedef alan yeni stratejilerin geliştirilmesi için de önemli klinik ilgi çekicidir.
Farklı tetikleyicilerden bağımsız olarak, yaşlanan hücreler, büyük vakuollerle genişlemiş, düzleşmiş, çok çekirdekli morfoloji, önemli ölçüde genişlemiş çekirdekler, çekirdekte H3K9me3 bakımından zengin yaşlanma ile ilişkili heterokromatin (SAHF) oluşumu, DNA hasar belirteci γH2AX odaklarının sürekli birikmesi, aktive edilmiş p53-p21CIP1 ve Rb-p16INK4a gibi bazı ortak özellikler sergiler. hücre döngüsü düzenleyici mekanizmalar, stabil G1 hücre döngüsü arresti, SASP'nin masif indüksiyonu ve yüksek yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal) aktivitesi14. Yaşlanmayı tanımlamak için tek bir belirteç yeterli olmadığından, yaşlanma tespiti için altın standart olarak kabul edilen SA-β-gal aktivitesi için enzimatik boyama, genellikle TIS15'i tespit etmek için H3K9me3 ve Ki67 için immünohistokimyasal boyama ile birleştirilir. Bununla birlikte, kimyasal kromojenik bazlı SA-β-gal'in ölçülmesi zordur. Burada, 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galaktopyranoside (C 12 FDG) floresan bazlı SA-β-gal (fSA-β-gal) tespitini, γH2AX ve EdU-dahil DNA için immünofloresan boyama ile birleştirerek, C 12 FDG + EdU-γH2AX+ yaşlanan hücreleri tanımlamak için hız, duyarlılık ve ayrıntılı tek hücreli görüntüleri akış sitometrisi ve mikroskopi ile sağlanamayan uzamsal bilgilerle birleştirdik. Bu yöntem, hücreler içindeki floresan sinyallerinin konumlandırılmasına ve nicelleştirilmesine izin veren yüksek çözünürlüklü görüntülerin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlarken, standart boru hatları oluşturarak birden fazla numunenin hızlı analizini lisanslar.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Fosfo (Ser139) Antikor</td><td>Biolegend</td><td>613407</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki-67 Fare Monoklonal Antikoru (Alexa Fluor 647)</td><td>Biolegend</td><td>350509</td><td></td></tr><tr><td>C12FDG (5-Dodekanoylaminofloresein Di-&beta;-D-Galaktopiranosid)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11590276</td><td></td></tr><tr><td>Klorokin -difosif</td><td>Sigma aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>Temizleyici (Coulter Clenz)</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Pasifik Mavi Akış Sitometri Test Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10418</td><td></td></tr><tr><td>Daunorubisin</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-13062A</td><td></td></tr><tr><td>Debubbler (%70 İzopropanol)</td><td>Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü Analiz yazılımı (Amnis&nbsp; FİKİRLER&nbsp; 6.3)</td><td>Luminex</td><td>CN-SW69-12</td><td></td></tr><tr><td>Cihaz ve görüntüleme yazılımı (Amnis&nbsp; ImageStreamX&nbsp; Mk II Görüntüleme Akış Sitometresi Sistemi ve INSPIRE yazılımı)</td><td>Luminex</td><td>100220</td><td></td></tr><tr><td>KARPAS</td><td>DSMZ</td><td>ACC 31</td><td></td></tr><tr><td>mafosfamid sikloheksilamin</td><td>Niomech</td><td>D-17272</td><td></td></tr><tr><td>OCI-LY1</td><td>DSMZ</td><td>ACC 722</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fisher Scientific</td><td>11473704</td><td></td></tr><tr><td>PETG (2-Feniletil-&beta;-D-tiyogalaktozid)&nbsp;</td><td>Sigma aldrich</td><td>P4902</td><td></td></tr><tr><td>saponin</td><td>Sigma aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Kılıf</td><td>Millipore</td><td>BSS-1006-B</td><td></td></tr><tr>ImageStream <td>Luminex</td><td>400041</td><td></td>Sterilizatörü<td>için SpeedBead</td></tr><tr><td>Kiti (% 0.4-0.7 Hipoklorit)</td> <td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>SU-DHL6</td><td>DSMZ</td><td>ACC 572</td><td></td></tr><tr><td>WSU-DLCL2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 575</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

tedaviye bağlı yaşlanan kanser hücrelerinde Çoklu floresan yaşlanma belirteçlerinin eşzamanlı görüntüleme ve akış sitometrisine dayalı tespiti

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Kemoterapötik ilaçlar, kanser hücrelerinde onarılamaz DNA hasarına neden olarak apoptoza veya erken yaşlanmaya neden olabilir. Apoptotik hücre ölümünün aksine, yaşlanma, kanser hücrelerinin yayılmasını kısıtlayan temelde farklı bir makinedir. Onlarca yıllık bilimsel çalışmalar, yaşlanan kanser hücrelerinin tümörlerde ve kanser hücrelerini ve stromal hücreleri modüle eden mikro ortamlarda karmaşık patolojik etkilerini ortaya koymuştur. Yeni kanıtlar, yaşlanmanın kanser tedavisi sırasında güçlü bir prognostik faktör olduğunu ve bu nedenle kanser örneklerinde yaşlanan hücrelerin hızlı ve doğru bir şekilde tespit edilmesinin gerekli olduğunu göstermektedir. Bu yazıda kanser hücrelerinde tedaviye bağlı yaşlanmayı (TIS) görselleştirmek ve saptamak için bir yöntem sunulmaktadır. Diffüz büyük B hücreli lenfoma (DLBCL) hücre hatları mafosfamid (MAF) veya daunorubisin (DN) ile tedavi edildi ve yaşlanma belirteci, yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-gal), DNA sentez belirteci 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) ve DNA hasar belirteci gama-H2AX (γH2AX) açısından incelendi. Akış sitometresi görüntüleme, kanser hücrelerindeki üç belirteci aynı anda görselleştirmek ve ölçmek için kısa sürede yüksek çözünürlüklü tek hücreli görüntüler üretmeye yardımcı olabilir.

Tek renkli kontrol örneklerinin kayıtlı verileri yüklenerek görüntü analiz yazılımı kullanılarak bir kompanzasyon matrisi oluşturulmuştur. Ek Şekil S1'de gösterildiği gibi, EdU'dan C12FDG'ye ihmal edilemeyen (katsayı değeri ≥ 0.1) bir ışık yayılımı 0.248 çapraz konuşma katsayısı değeri ile tespit edilirken, diğer kanallar arasındaki çapraz konuşma anlamlı değildi. Dört farklı DLBCL hücre hattı, hücresel yaşlanmayı indüklemek için 5 μg / mL MAF veya 20 ng / mL DN ile tedavi edildi ve geleneksel...

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Bu yöntem, birden fazla numunenin hızlı bir şekilde analiz edilmesine izin verirken, hücrelerdeki floresan sinyallerinin uzamsal dağılımının ve miktarının analizine izin veren yüksek çözünürlüklü görüntüleri hızla üretebilir. Hücreler, gelişmiş görüntüleme akışı sitometri sistemi kullanılarak ölçülür, hız, hassasiyet ve ayrıntılı tek hücreli görüntüleri, akışlar optometrisi veya mikroskopi tarafından sağlanamayan benzersiz veriler veren uzamsal bilgilerle birleştirir. Önemli bir tavsiye, cihaz ayarlarını oluşturmak için yeterli hücre sağlamaktır ve ölçümleri için hücreleri yüksek yoğunlukta askıya alırız.Bunun dışında veri toplama basittir ve geleneksel akış sitometrisine benzer. İlk önce makalede açıklandığı gibi DLBCL hücre çizgilerini oluşturun. Daha sonra DLBCL hücre kültürüne bir ila 1000 oranında 10 milimolar EdU çözeltisi ekleyin ve plakayı hafifçe sallayarak karıştırdıktan sonra üç saat boyunca plakayı% 5'lik bir karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin.Kuluçkadan sonra plakayı çıkarın ve 75 mikromolar'lık bir son konsantrasyona 100 milimolar klorokin çözeltisi ekleyin. Hafifçe sallayarak karıştırın ve 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Ardından, 20 m

simultaneous-imaging-flow-cytometry-based-detection-multiple

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Bu video, çift yaşlanma belirteçleri ile tedaviye bağlı yaşlanan kanser hücrelerini ölçmek için akış sitometrisi tabanlı bir testi göstermektedir. Yaşlanan hücrelerin tespiti ve miktarının belirlenmesi, bir β-galaktosidaz substratının kullanılmasını içerir. Substrat, yaşlanan hücreler içindeki aktif lizozomal β-galaktosidaz ile parçalanır ve otofloresan lipofusin granülleri ile birlikte yaşlanan kanser hücrelerini işaretleyen bir floresan ürün üretir.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinin Akış Sitometrisine Dayalı Miktar Tayini

Bu video, tümör  dokusunda sızan T hücrelerinin farklı alt popülasyonlarını analiz etmek için yerinde floresan multispektral görüntüleme tekniğini göstermektedir. Bir renal hücreli karsinom doku kriyoseksiyonu, spesifik inhibitör reseptörleri eksprese eden ve immünoterapiye dirençli bir fenotip sergileyen CD8 + T hücrelerini etiketlemek için antikorlarla tedavi edilir. Etiketli bölüm, farklı CD8 + T hücresi alt popülasyonlarını tanımlamak için multispektral bir mikroskop kullanılarak...

İmmünoterapiye Dirençli T Hücresi Alt Popülasyonlarını Analiz Etmek için Çoğullanmış İmmünofloresan Görüntüleme

Yaşlanması önler veya tümörogenez tartışmalıdır teşvik olsun. Kemoterapik ilaçlar senesce için kanser hücrelerinin neden olabilir bu yana, yaşlılık okuyan yeni tedaviler önermek için gereklidir. Ancak, standart ve geniş kullanılan β-galaktosidaz tahlil büyük sakıncaları sunar. Burada yaşlılık ölçmek için hızlı ve hassas akım sitometri bazlı analiz öneriyoruz.

Senesent Kanser Hücreleri ölçmek için bir Hassas Yöntem

Hücresel senesans, Yaş ile ilgili kronik patolojilerin gelişiminde önemli bir faktördür. Parlak hücreleri hedefleyen terapinin tanımlanması, sağlıklı yaşlanmanın uzatılması için söz veriyor. Burada, tek hücrelerde senesans ilişkili β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümüne dayalı senoterapötik teşhis için ekrana bir roman tahlil sunuyoruz.

Senoterapötik Ilaçların tanımlanması için SA-β-Galactosidaz tabanlı tarama tahlili

Fare beyninden veya omurilikten alınan farklı hücre tiplerini aynı anda belirlemek için bir akış sitometri yöntemi sintometri sitometri sitometri sitometrisi sintometrisi sitometri sintometrisi sintometrisi sintometri Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda saf hücre popülasyonlarını izole etmek veya karakterize etmek veya viral vektörlerin veya nano partiküllerin in vivo uygulamasında hücre hedeflemesinin kapsamını ölçmek için kullanılabilir.

Farklı Homojenizasyon Yöntemleri ile Fare Beyin/Omurilikten Alınan Çoklu Hücre Tiplerinin Eşzamanlı Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Kemoterapi ilaçlarının hücre kültüründe veya murin tümör modellerinde indüklediği yaşlanan kanser hücrelerinin floresan, akım sitometrik nicelleştirilmesi için bir protokol sunulmuştur. İsteğe bağlı prosedürler arasında ko-immün boyama, büyük parti veya zaman noktası analizini kolaylaştırmak için numune fiksasyonu ve akış sitometrik sıralama ile canlı yaşlanan hücrelerin zenginleştirilmesi yer almaktadır.

Akış Sitometrisi ile Yaşlanan Tümör Hücrelerinin Tanımlanması ve Zenginleştirilmesi için Uzak Kırmızı Floresan Yaşlanma İlişkili β-Galaktosidaz Probu

Çoklu immünoflüoresans, doku mimarisi ve hücre popülasyonlarının mekansal analizini desteklemek için tek bir doku bölümünde birden fazla antikor belirteçinin ardışık olarak etiketlenmesini sağlar. Burada, yaşlanma ile ilişkili, yapısal ve bağışıklık belirteçlerinin çoklu algılanması için manuel ve otomatik slayt hazırlığı, yinelemeli görüntüleme ve dijital patoloji yazılımı kullanılarak tek hücre analizi dahil olmak üzere bir iş akışı sunulmaktadır.

Yaşlanma Belirteçlerinin Mekansal Değerlendirmesi İçin Multipleksli İmmünoflüoresans Testi

Bir verimli tarama Protokolü glioblastoma kök hücreler (GSCs) astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için sunulmaktadır. Tahlil sayede gelişmiş GFP (eGFP) ifade insan GFAP'nin düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir bir kök hücre farklılaşması muhabir temel alır.

Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi

Burada kollarındaki kullandığımız, x-ışını nasıl inhibe mTOR etkinlik çalışmaya ve pozitron emisyon tomografi/bilgisayarlı tomografi Imaging etkileri myeloma kemik iliği engrafted tümörler bir xenograft modeli. Bu myeloma kemik iliği engrafted tümör vivo içindehedefleme terapiler Anti-miyelom etkisini fizyolojik ilgili, non-invaziv ve multimodal analizleri için sağlar.

Multipl Miyelom kemik iliği Xenografts NOG farelerde Multimodal kollarındaki ve pozitronik emisyon tomografi/Hesaplamalı tomografi görüntüleme

Keşfedin, görüntüleme akış sitometrisiyle tedaviye bağlı yaşlanan kanser hücrelerinde çoklu floresan yaşlanma belirteçlerinin eşzamanlı tespiti. Bu yöntem, yüksek çözünürlüklü görüntüler üreterek tek hücre düzeyinde hızlı ve hassas analiz sağlar.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti (Video) | JoVE Journal

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Daha fazla video keşfet